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磺胺类药物(sulfonamides, SAs)是一类广泛应用于畜牧业的广谱抗菌药物,但由于其不合理使用甚至滥用造成了动物源食品中药物残留问题,影响食品安全,进而危害人类健康。建立快速、高效、广谱、可靠的检测方法监控动物源食品中SAs残留,对食品安全和人类健康保障具有重要意义。本文以磺胺类药物受体蛋白二氢叶酸合成酶(Dihydropteroate Synthase, DHPS)为研究对象,建立快速检测方法检测牛奶中磺胺药物多残留。体外扩增来源于肺炎链球菌R6和大肠杆菌ATCC25922的flop基因,分别构建表达载体flop-pET28b,优化诱导表达条件,发现诱导温度20℃、诱导时间14～17h和0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG)时诱导效果最佳。采用镍柱亲和层析和离子交换方法纯化DHPS蛋白,通过纯化条件优化,发现100mM咪唑为最适洗脱缓冲液浓度。100mL大肠杆菌培养物可获得约3mg目的蛋白。采用二环己基碳二亚胺(Dicyclohexylcarbodiimide,DCC)法偶联辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)与磺胺类药物及其衍生物,获得7种酶标记物,其中4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸(4-(4-amino-benzenesulfonylamino) benzoic acid,CS)-HRP与DHPS结合力最强,对磺胺二甲基嘧啶(Sulphamethazine, SM2)的灵敏度最高。以CS-HRP与来源于肺炎链球菌的DHPS组合建立微孔板法检测SAs多残留,进行了条件优化,分别以31种磺胺类药物及其类似物建立标准曲线,其中29种磺胺类药物的IC50(50%结合时待测物浓度)值为2.95～56.22ngmL-1,均低于最高残留限量(Maximum Residue Limit,MRL)。以CS-HRP与来源于大肠杆菌的DHPS组合建立微孔法检测SAs多残留,29种磺胺类药物的IC50值为6.16～182.27ng mL-1,选择CS-HRP与来源于肺炎链球菌的DHPS组合建立微孔板法检测牛奶中SAs多残留,纯牛奶稀释5倍、脱脂牛奶稀释3倍即可用于检测。纯牛奶中磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine,SMM)、磺胺喹噁啉(Sulfaquinoxaline,SQX)、SM2、磺胺甲基异嗯唑(Sulfamethoxazole,SMZ)和磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM)的添加回收率为83.3～108.8%,变异系数为1.1～15.8%；脱脂奶中的添加回收率为72.7～129.3%,变异系数为3.0～16.0%。为简化快速检测方法,用焦磷酸盐(pyrophosphate,PPi)取代DHPS的第一底物6-羟甲基-7,8二氢蝶呤焦磷酸盐(6-hydroxymethyl-7,8-dihydropterin pyrophosphate, DHPPP),以CS-HRP与来源于肺炎链球菌的DHPS组合建立SAs残留微孔板检测方法,进行了条件优化,其中9种SAs和PABA的检测限(limit of detection,LOD)低于MRL值,28种磺胺类药物的IC50值为426～50000ngmL-。合成了7种荧光标记物,以来源于肺炎链球菌的DHPS和最佳荧光标记物CS-BDF组合建立检测牛奶中SAs多残留的荧光偏振分析方法(Fluorescence Polarization Immunoassay, FPIA).进行了条件优化,29种SAs的IC50值为4.90～108.24ng mL-1, PABA的IC50值最低,为3.80ng mL-1。牛奶中SMM、SQX、SM2、SMZ和SDM的回收率为53.3～101.9%,变异系数为0.29-19.7%。为了深入了解DHPS与磺胺类药物的相互作用,为方法灵敏度的提高和DHPS体外进化提供理论基础,本研究利用Surflex-X-2.0对DHPS与6种SAs进行分子对接研究,并给出评分,相对亲和力的变化趋势与评分结果基本一致。DHPS与SAs作用的2个关键氨基酸残基为Ⅱe272和Asp221,疏水作用力是其相互作用的决定因素。综上所述,本研究获得了磺胺类药物受体蛋白DHPS,其对磺胺药物的亲和力高、广谱性好,可代替抗体应用于快速检测方法建立。