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真核生物染色体的末端结构由端粒和亚端粒序列组成。在维持染色体的稳定性具有重要的作用。虽然对端粒酶介导的端粒复制机制已有深入的研究,但是,DNA重组介导的端粒和亚端粒序列变化,以及这些变化与植物生长发育的关系不甚清楚。本论文以水稻“中花11”(Oryza sativa L.ssp.Japonica,zhonghua11)为材料,采用末端限制性片段分析法(Terminal Restriction.Fragment,TRF)研究水稻端粒和亚端粒区域在生长发育、细胞分裂、分化及衰老过程中的变化。通过基因打靶将外源基因定向整合到水稻染色体2S亚端粒区域,并研究了该区域变化对水稻生长发育的影响。获得了以下结果:
1.采用TRF法分析水稻端粒重复序列的长度变化时发现,MseⅠ酶解后的水稻基因组DNA与端粒重复序列(TVTAGGG)58的探针杂交时,表现出清晰的杂交条带,说明水稻端粒区域可能含有该酶的识别序列(T/TAA)。采用该方法对其它植物包括烟草、拟南芥、玉米、小麦进行研究时,这些物种都不会显现出清晰的杂交条带。进一步研究发现,不同的水稻品种,以及同一品种的不同单株中TRF带型均不相同,说明端粒序列的长度存在着动态变化。因此,利用TRF分析可以检测水稻端粒重复序列长度的变化。
2.利用TRF分析研究了1S,2S以及2L亚端粒序列在水稻细胞分裂、分化及衰老各阶段的变化。发现在水稻不同的生长发育时期亚端粒区域存在着杂交带型的差异。用1S亚端粒区域的探针进行TRF分析时,杂交带型的主要差异在10kb附近的区域:在幼苗和旗叶中杂交带型表现一致,分别为约6kb,10kb以及15kb的三条带；根中只有6kb和10kb两条杂交条带；而愈伤组织中只在10kb附近有一条模糊的条带。以2S探针进行TRF分析时,各组织中主要差别在10kb附近的高分子区域。同时发现,使用MseⅠ酶解后,在1.5kb处出现一片模糊的条带,推测可能是由2S亚端粒区域的高频重组所导致。以2L亚端粒为探针时,愈伤组织和根中都出现了12kb附近的两条杂交带,幼苗中在15kb附近有两个较强的杂交信号,而旗叶中15kb处信号较弱,在6kb处检测到较强的杂交信号。上述结果说明,水稻亚端粒区域在生长发育过程中存在着重组。
3.水稻生长发育过程中部分染色体端粒间存在重组现象。Southern Blot结果显示:1S/2L、1S/4L端粒之间杂交条带的数量约为2S/2L、2S/4L之间的50％,说明在1S/2L、1S/4L端粒之间的重组频率比2S/2L和2S/4L端粒之间的重组频率低。在1S/2L中的幼苗组织中只检测到一条杂交带,而1S/4L旗叶中检测到6条杂交带。在2S/2L和2S/4L的各种组织材料中,除了2S/2L的根中重组发生频率较低,检测到4个杂交信号外。其他的三种组织中均检测到较高的重组频率,最多的杂交条带为12条。PCR产物经克隆测序后比对发现,序列包含了亚端粒特异序列和端粒重复序列。发现水稻生长发育过程中部分染色体端粒间存在重组现象且发生频率存在着差别。
4.采用单个端粒长度分析(Single telomere length analysis,STELA)对水稻生长发育过程中染色体2S端粒长度的变化进行分析发现,水稻染色体2S端粒长度在生长发育过程中存在着多态性。愈伤中存在约为6kb,2.5kb,1.8kb和1.5kb的4条杂交带；幼苗中存在1.5～6kb之间的7条带；而旗叶中存在大于4kb的4条带,最长的约为10kb。使用MseⅠ酶解的样品杂交条带比没有酶解的缩短约1kb,恰好为2S特异引物到端粒重复序列的长度。以上实验结果证实,2S染色体的端粒长度在水稻生长发育过程中存在着变化。从带型的独立性和一致性分析,这些变化可能是由染色体端粒区域的重组引起的。
5.以水稻染色体2S亚端粒区域包含PDI基因的7.8kb片段为同源区域构建了基因打靶载体,利用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织。通过PCR,Southern Blot和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验鉴定基因打靶事件。对3次独立的农杆菌转化实验中的578株抗性转基因幼苗进行PCR鉴定,得到32株成功打靶植株,基因打靶频率为5.54％。约为水稻其他位点基因打靶频率的500倍,说明亚端粒区域的重组频率远远高于染色体其他区域。
6.Southern Blot验证基因打靶的T1子代植株,没有检测到纯合植株。进一步PCR鉴定实验证实,基因打靶植株可能为纯合致死型。而对PDI基因的超表达和RNAi抑制的转基因植株表型分析发现与野生型植株一致。说明外源DNA插入水稻2S亚端粒区域可能通过改变该区域结构导致纯合致死。
7.非生物胁迫实验显示,基因打靶植株对胁迫敏感。在NaCl处理7天时,50mM的浓度下基因打靶植株株高为2.48cm,与野生型植株的6.22cm相比存在显著性差异,而超表达OsPDI和RNAi-OsPDI的植株株高分别为5.96cm和5.94cm,与野生型植株基本一致。同样,在100mM和150mM的NaCl条件下,基因打靶植株与其他三组样品也表现出显著性差异。甘露醇处理时,浓度在50mM时,打靶植株株高为3.01cm,约为其他三组的50％。更高浓度的甘露醇处理时,打靶植株同样表现出显著性差异。
上述实验结果表明,水稻的生长发育过程中的染色体末端存在高频率的重组。这些变化可能在植物的生长发育过程中以及植物对外界环境响应的过程中具有重要的作用。