论文部分内容阅读
研究背景: microRNAs（miRNAs）是一类非编码的长度大约19～24个核苷酸的单链小RNA分子，参与靶基因转录后水平的调控。成熟的miRNA可以通过和下游靶基因mRNA的3UTR以非完全匹配方式相结合，从而干扰和抑制靶基因mRNA的翻译。此外，miRNA还可以通过使靶基因mRNA脱腺苷酸化的作用从而降解靶基因mRNA以此抑制靶基因的表达。miRNA广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、应急反应、免疫反应等多种生命活动过程，作为癌基因或抑癌基因对肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移以及血管生成的调节发挥着重要作用。目前通过miRNA芯片杂交方法许多恶性肿瘤的miRNA表达谱得以建立，其中一些miRNA成为肿瘤治疗的新的靶点并成为临床患者预后的肿瘤标志物。当然，miRNA在食管癌中的研究也越来越多，随着研究的不断深入，大量的miRNA在食管癌中的作用得以明确。近年来研究发现miR-675在人类结肠癌、胰腺癌、浆液性子宫内膜癌和子宫内膜癌肉瘤表达上调，和COPD患者相比，miR-675在肺癌患者的血液中也呈过表达。最近H19被证实是miR-675的前体，并且H19在人类肝癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、睾丸癌、绒毛膜癌、结肠癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、食管癌等恶性肿瘤中也被发现过表达。鉴于H19在食管癌组织中高表达并且H19是miR-675的前体，我们推测miR-675可能在食管癌的发生和发展过程中同样发挥了重要作用，而此研究国内外尚无报道，于是我们进行了本课题的研究。由于H19可以转录合成成熟的miR-675-5p及miR-675-3p两个片段序列，在本课题研究中我们选用miR-675-5p进行研究。 目的: 研究miR-675-5p在食管鳞癌组织中的表达水平及其临床病理意义，同时观察miR-675-5p对食管鳞癌细胞生物学行为以及细胞通路的影响并预测其靶基因。 方法: 1.通过实时荧光定量PCR技术检测H19、miR-675-5p在食管鳞癌组织及细胞系中的表达情况，分析二者的相关性，并重点分析H19、miR-675-5p与食管鳞癌患者临床病理特征的相关性; 2.通过慢病毒感染Eca109和EC9706细胞，上调和下调Eca109和EC9706细胞中miR-675-5p的表达，观察其对食管鳞癌细胞增殖、周期分布、细胞凋亡、侵袭迁移能力以及裸鼠致瘤等细胞生物学特性的影响; 3.采用荧光素酶报告基因实验方法观察miR-675-5p在Eca109和EC9706细胞中对预测靶基因的作用并进行验证; 4.通过实时荧光定量PCR和Western免疫印迹观察靶基因REPS2mRNA及蛋白水平在慢病毒转染LV-miR-675-precursor和LV-miR-675-5p-inhibition后在Eca109及EC9706细胞系中的表达情况，同时应用Western免疫印迹观察RAC1、CDC42蛋白在慢病毒转染LV-miR-675-precursor和LV-miR-675-5p-inhibition后在Eca109及EC9706细胞系中的表达情况; 5.通过实时荧光定量PCR及Western免疫印迹观察REPS2 mRNA和蛋白在食管鳞癌组织及细胞系中的表达情况，并通过免疫组织化学方法研究120例食管鳞癌组织中REPS2蛋白的表达情况，并分析REPS2蛋白在食管鳞癌组织中的表达水平与临床病理特征和患者预后之间的关系。 结果: 1.miR-675-5p及H19 mRNA在食管鳞癌组织中的表达水平均较癌旁组织和正常组织明显上调，并且在四株食管鳞癌细胞系中的表达水平亦均较正常食管上皮细胞系HEEpic明显上调。同时miR-675-5p和H19 mRNA在食管癌组织及细胞系中表达比值的对数函数值均呈正相关。 2.miR-675-5p与食管鳞癌患者的肿瘤浸润程度、TNM分期和淋巴结转移相关，而H19 mRNA与食管鳞癌患者的TNM分期和淋巴结转移相关。 3.miR-675-5p的上调促进体外食管鳞癌细胞的生长、增殖、克隆形成、侵袭和迁移，抑制细胞的凋亡和降低细胞周期G1期阻滞，并且促进体内裸鼠致瘤移植物的生长;而miR-675-5p的下调则抑制体外食管鳞癌细胞的生长、增殖、克隆形成、侵袭和转移，诱导细胞的凋亡和增加细胞周期G1期阻滞，并且抑制体内裸鼠致瘤移植物的生长。 4.荧光素酶报告基因实验表明REPS2是miR-675-5p的直接作用靶基因。 5.miR-675-5p的上调和下调并不影响REPS2 mRNA的转录水平，但是可以导致REPS2蛋白表达水平下调和上调，并且导致RAC1、CDC42蛋白表达水平上调和下调。 6.REPS2 mRNA和蛋白在食管鳞癌组织中的表达水平均较癌旁组织和正常组织明显下调，并且在四株食管鳞癌细胞系中的表达水平亦均较正常食管上皮细胞系HEEpic明显下调。同时miR-675-5p和REPS2 mRNA在食管癌组织中表达比值的对数函数值呈负相关。 7.REPS2蛋白表达与食管鳞癌患者的肿瘤浸润程度、TNM分期、淋巴结转移和肿瘤复发相关。REPS2蛋白低表达食管鳞癌患者较高表达患者相比五年总体生存率和无病生存率均较低，REPS2蛋白低表达/淋巴结转移(+)食管鳞癌患者拥有更低的五年总体生存率和无病生存率。REPS2蛋白表达水平是食管鳞癌患者预后影响因素的一个独立危险因素。 结论: 1.miR-675-5p及H19 mRNA在食管鳞癌组织及细胞中的表达水平上调，并且二者在食管鳞癌组织及细胞中表达比值的对数函数值均呈正相关。 2.miR-675-5p与食管鳞癌患者的肿瘤浸润程度、TNM分期和淋巴结转移相关，而H19 mRNA与食管鳞癌患者的TNM分期和淋巴结转移相关。 3.miR-675-5p可以促进体外食管鳞癌细胞的生长、增殖、克隆形成、侵袭和迁移，抑制细胞的凋亡和降低细胞周期G1期阻滞，并且促进体内裸鼠致瘤移植物的生长。 4.REPS2是miR-675-5p的直接作用靶基因，miR-675-5p对REPS2表达水平的调控是一种转录后水平的调控，并且参与调节Ras/Ral信号通路的转导。 5.REPS2 mRNA和蛋白在食管鳞癌组织及细胞中的表达水平下调，并且miR-675-5p和REPS2 mRNA在食管癌组织中表达比值的对数函数值呈负相关。 6.REPS2蛋白表达与食管鳞癌患者的肿瘤浸润程度、TNM分期、淋巴结转移和肿瘤复发相关，影响患者的生存预后，并且是食管鳞癌患者预后的一个独立危险因素。