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胆道闭锁(biliary atresia,BA)是新生儿和婴儿阻塞性黄疸常见的原因之一。BA的特点为肝内、外胆管狭窄或中断,导致胆汁排除困难,其病理特征是进行性炎症和纤维化。肝门空肠吻合术(Kasai术)虽可延长部分BA患儿的生命,却不能延缓和逆转纤维化。防治BA术后肝纤维化的手段非常有限。肝纤维化贯穿BA整个过程。在BA早期,肝纤维化虽然尚未出现,但其相关因子已被激活。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是其主要的参与者。TGF-β 1/smad通路是肝纤维化最重要的调控方式之一,与HSCs的激活密切相关。细胞外基质的沉积和降解决定了肝纤维化的发展方向。而MMP9/TIMPs与细胞外基质紧密联系。MMP9是一种胶原蛋白的主要降解酶,而TIMPs是MMP9的主要内源性抑制因子,与MMPs的活性位点结合,抑制其活性。由于肝纤维化具有一定的可逆性,抗纤药物在BA早期进行干预可能有效地防治BA肝纤维化。本课题组在国内率先展开中医药治疗BA的系列临床和实验研究。临床发现,BA Kasai术后患儿有阳虚、湿困、血瘀的特点,治疗上多运用温阳化湿活血法。以加味茵陈四逆汤为基础方治疗BA患儿,发现其可改善胁下肿块性质、腹胀及食欲等症状体征及肝功能指标,减少胆管炎的发作频率,有效地降低BA术后患儿血清透明质酸、层粘蛋白、Ⅳ型胶原和Ⅲ型胶原,改善肝纤维化。同时,本课题组开展了一系列的细胞和动物实验,探索加味茵陈四逆汤治疗BA肝纤维化的作用靶点。发现加味茵陈四逆汤可下调TGF-β 1干预的大鼠HSCs-T6中smad3,collagen Ⅲ蛋白的表达,在离体条件下可以延缓肝纤维化;亦可下调肝纤维化小鼠肝脏组织中TβRⅠ、smad3的表达,上调smad7表达,抑制collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表达,亦可上调MMP1表达,抑制TIMP1、TIMP2表达,发挥对肝纤维化的抑制作用。本临床研究在前期研究的基础上,开展BA Kasai术后患儿临床症状的总结以及处方、用药规律的分析,以期形成系统规范。本实验研究是国家自然科学基金项目“加味茵陈四逆汤对胆道闭锁小鼠肝纤维化模型TGF-β 1/smads通路及MMPs/TIMPs的影响研究(课题编号:81373686)”的部分内容。本课题组前期完成了肝纤维化动物模型的部分实验。本次研究采用腹腔注射恒河猴轮状病毒(rhesus monkey rotavirus,RRV)的方法成功构建BA新生鼠模型,以加味茵陈四逆汤为千预药物,从TGF-β1/smads通路及MMP9/TIMPs平衡出发,探索本方治疗BA的作用靶点。目的:1.本研究运用“中医传承辅助系统(V2.5)”软件,对BA Kasai术后患儿的症状、并发症、中药处方规律进行数据挖掘和分析,旨在总结和分析岭南黎氏儿科治疗BA的经验,为中医药防治BA术后症状提供一定的依据。2.观察加味茵陈四逆汤对RRV诱导的BA新生鼠的治疗作用,研究其对BA的症状、肝质量、肝指数及肝脏病理组织学的影响,并从TGF-β 1/smads通路及MMP9/TIMPs平衡探寻其潜在的作用靶点。方法:1.临床研究本研究展开BA Kasai术后患儿的临床症候的总结和处方、用药规律的分析。本次纳入2017年12月至2018年12月广州中医药大学第一附属医院儿科33名诊断为BAKasai术后患儿。采用“中医传承辅助系统(V2.5)”软件,使用“临床采集”模块录入BA患儿的医案,运用“统计报表”的“医案统计”功能,对性别、症状、并发症、药物频次、四气五味、归经进行统计分析;运用“数据分析”的“方剂分析”功能分析处方规律和新方组合。2.实验研究2.1不同滴度RRV构建BA新生鼠模型2.1.1实验分组及干预SPF级Balb/c新生鼠(51只)随机分为A、B、C组(n=17)。A、B、C组分别在出生24小时内给予腹腔注射30ul 105 PFU/ml、106PFU/ml、107 PFU/ml的RRV。记录各组新生鼠出现黄染的只数,计算黄染比例;记录各组黄染出现的天数和存活天数,并绘制生存曲线。2.2加味茵陈四逆汤对BA模型新生鼠的干预2.2.1实验分组将SPF级Balb/c新生鼠(60只)随机分成6组:空白组、模型组、加味茵陈四逆汤高剂量组、加味茵陈四逆汤中剂量组、加味茵陈四逆汤低剂量组和熊去氧胆酸组(n=10)。2.2.2给药方法空白组正常饲养。余组新生鼠均在出生24小时内给予腹腔注射30ul 106 PFU/ml RRV成功构建BA新生鼠模型,并于生后第5天开始灌胃,1次/日,连续7天。其中加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组分别给予加味茵陈四逆汤3.47g/(kg·d)、1.73g/(kg·d)、0.87g/(kg·d)灌胃,熊去氧胆酸组给予熊去氧胆酸溶液1.08mg/(kg·d)灌胃,模型组给予10ml/(kg·d)0.9%NaCl溶液灌胃。2.2.3研究指标(1)连续观察小鼠体重并绘制体重变化曲线(5～12天),观察小鼠黄染变化情况;(2)于生后第12天腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg麻醉新生鼠。采集肝组织,记录肝脏质量,并计算肝指数(肝指数=肝脏质量/体重×100%);(3)对各组肝脏组织行HE染色;(4)采用 RT-qPCR 检测肝组织中 T β R Ⅰ mRNA、smad3 mRNA、collagen Ⅰ mRNA、collagen Ⅲ mRNA 的表达;(5)采用 RT-qPCR 检测肝组织中 MMP9 mRNA、TIMP1 mRNA、TIMP2 mRNA 的表达;(6)采用 Western Blotting 检测肝组织中 TβR Ⅰ 蛋白、smad3 蛋白、collagen Ⅰ蛋白、collagen Ⅲ蛋白的表达;(7)采用Western Blotting检测肝组织中MMP9蛋白、TIMP1蛋白、TIMP2蛋白的表达。结果:1.临床研究(1)对33例BA Kasai术患儿的病案进行统计分析,男女比例为5:3;(2)对症状进行频次分析,发现胁下痞块(33/33),面色少华(32/33),腹胀(26/33),黄染(23/33),生长迟缓(23/33),腹壁静脉显露(20/33),大便淡黄(8/33),纳呆(4/33),手足欠温(3/33);(3)对并发症进行频次分析,发现肝功能异常(31/33),肝纤维化(27/33),胆管炎(23/33),贫血(20/33),脾大(10/33),脐疝(3/33),肝硬化(2/33),营养不良(1/33),脾功能亢进(1/33),血小板减少(1/33),脓毒血症(1/33)。(4)对33首治疗BA Kasai术后的处方中的药物频次进行统计,处方共涉及67味中药,频次≥5的有27味中药,其中前20位分别是茵陈、甘草、木香、苍术、川芎、茯苓、猪苓、淡附片、姜厚朴、虎杖、大黄、栀子、建曲、醋鳖甲、陈皮、泽泻、蒲公英、太子参、赤芍、千姜。(5)药物四气以寒、温性为主,五味以苦、辛、甘为主,主归脾胃、肝经。(6)在支持度为25%,置信度设为0.9,共得到11种药物模式和11条规则,包含6味中药,即茵陈、川芎、茯苓、苍术、木香、甘草。(7)选择相关度8、惩罚度2,采用聚类分析,提取出6个新方组合。新方1:黄苓、猪苓、柴胡、黄柏。新方2:车前子、车前草、白术、干姜。新方3:皂角刺、蒲公英、酒萸肉、金钱草。新方4:淡附片、茯苓、太子参、金银花。新方5:蒲公英、太子参、大黄、陈皮。新方6:栀子、太子参、虎杖、大黄。2.实验研究(1)不同滴度RRV构建BA模型的黄染率A组新生鼠黄染率为76.47%,B组新生鼠黄染率为88.23%,C组新生鼠黄染率为100%。C组黄染率比A组高(P<0.01)。(2)不同滴度RRV构建BA模型的黄染出现时间及生存时间与A组比较,B、C组黄染出现时间早(P<0.01);与B组比较,C组黄染出现时间无显著差异(P>0.05)。与A组比较,B、C组生存率降低(P<0.01);与B组比较,C组生存率降低(P<0.01)。通过生存曲线分析,A组BA阳性鼠中位生存期约在14天左右,B组BA阳性鼠中位生存期约在13天左右,C组BA阳性鼠中位生存期约在10天左右。(3)加味茵陈四逆汤对BA小鼠症状的影响与空白组比较,BA模型组小鼠出现黄染,体重增长迟缓、停滞;与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组和熊去氧胆酸组小鼠体重有不同程度地增加,黄染减轻。(4)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝脏质量和肝指数的影响与空白组比较,BA模型组肝脏质量明显降低(P<0.01);与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中剂量组肝脏质量均明显增加(P<0.01),加味茵陈四逆汤低剂量组、熊去氧胆酸组肝脏质量无显著差异(P>0.05)。与空白组比较,模型组肝指数增加(P<0.01);与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组和熊去氧胆酸组肝指数均显著降低(P<0.01)。(5)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝组织HE染色的影响与空白组比较,BA模型组肝组织汇管区周围大量的炎症细胞聚集;与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组和熊去氧胆酸组汇管区炎症细胞有不同程度地减少。(6)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝组织中Tβ R Ⅰ mRNA及TβRⅠ蛋白表达的影响与空白组比较,模型组Tβ R Ⅰ mRNA及TβRⅠ蛋白相对表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组及熊去氧胆酸组Tβ R Ⅰ mRNA及Tβ RⅠ蛋白的相对表达量均明显降低(P<0.05或P<0.01)。(7)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝组织中smad3 mRNA及smad3蛋白表达的影响与空白组比较,模型组smad3 mRNA及smad3蛋白相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组smad3 mRNA及smad3蛋白相对表达量降低(P<0.05或P<0.01),熊去氧胆酸组smad3蛋白相对表达量均降低(P<0.05),但熊去氧胆酸组smad3 mRNA相对表达量虽有降低,但无统计学意义(P>0.05)。(8)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝组织中collagen Ⅰ mRNA及collagen Ⅰ蛋白表达的影响与空白组比较,模型组collagen Ⅰ mRNA及collagen Ⅰ蛋白相对表达量无明显差异(P>0.05);与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组和熊去氧胆酸组collagen Ⅰ mRNA及collagen Ⅰ蛋白相对表达量无明显差异(P>0.05)。(9)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝组织中collagen Ⅲ mRNA及collagen Ⅲ蛋白表达的影响与空白组比较,模型组collagen Ⅲ mRNA及collagen Ⅲ蛋白相对表达量无明显差异(P>0.05);与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组和熊去氧胆酸组collagen Ⅲ mRNA及collagen Ⅲ蛋白相对表达量无明显差异(P>0.05)。(10)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝组织MMP9 mRNA及MMP9蛋白表达的影响与空白组比较,模型组MMP9 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),模型组MMP9蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组MMP9 mRNA及MMP9蛋白相对表达量,差异无统计学意义(P>0.05)。(11)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝组织TIMP1 mRNA及TIMP1蛋白表达的影响与空白组比较,模型组TIMP1 mRNA及TIMP1蛋白相对表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,加味茵陈四逆汤低剂量组及熊去氧胆酸组TIMP1 mRNA及TIMP1蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01),加味茵陈四逆汤中剂量组TIMP1 mRNA及TIMP1蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05),加味茵陈四逆汤高剂量组TIMP1 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05),而加味茵陈四逆汤高剂量组TIMP1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。(12)加味茵陈四逆汤对BA小鼠肝组织TIMP2 mRNA及TIMP2蛋白表达的影响与空白组比较,模型组TIMP2 mRNA及TIMP2蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组和熊去氧胆酸组TIMP2 mRNA及TIMP2蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.临床研究(1)结合BA术后症状、证候特点、并发症,从中医的角度分析,本病可归属于“黄疸”或“癥瘕”等范畴。胁下痞块、腹壁静脉显露提示患儿存在脉络瘀阻。面色少华提示患儿存在气血亏虚、脾虚。腹胀、纳呆提示存在水湿运化障碍。黄染可辨寒湿或湿热蕴结肝胆。生长迟缓、手足不温表明患儿先天肾气亏虚、肾阳不足。故本病的病机为虚实夹杂,考虑先天脾肾不足,与“瘀”、“湿”、“热”合而致病。在治疗上,当以健脾温阳、利湿、化湿、退黄、活血化瘀、行气为则。(2)在并发症中,最常见的为肝功能异常。术后肝纤维化、反复发作的胆管炎发病率高,严重影响了 BA患儿的生长发育。这表明BA患儿存在肝胆湿热、胆汁外溢,当以清热利湿治之。(3)在纳入的33例患儿的处方中,药物四气以寒性、温性为主,五味以苦、辛、甘为主,主归脾胃、肝经。这体现了黎氏儿科治疗BA用药时“温清并进”的学术思想。(4)本研究对纳入的33例患儿的中药处方进行分析,发现前20位中药进行分析,归纳总结出治疗BA术后患儿的指导方:加味茵陈四逆汤、茵陈蒿汤、异功散、五苓散等,为后续开展中医药治疗BA的机制研究奠定了基础。(5)在支持度为25%,置信度为0.9时,得出11种药物模式和11条规则,由茵陈、川芎、茯苓、苍术、木香、甘草6味药物组成,其中茵陈退黄、川芎化瘀、茯苓运脾、苍术燥湿,木香行气、甘草和中,体现了岭南黎氏儿科治疗BA时“攻补兼施”的学术理念,以运脾化湿,行气化疲为主,使黄随湿退。(6)在相关度8、惩罚度2时,经聚类分析,提取出6个新方组合。在提取的6个新方组合中,药物多为寒、温搭配,这也体现了岭南黎氏儿科在治疗BA Kasai术后的“清温并进、攻补兼施”的学术思想,为BA术后患儿出现的肝胆湿热证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证等的治疗提供新思路。2.实验研究(1)RRV病毒滴度越高,BA阳性鼠黄染出现时间越早,黄染率越高,预示着造模成功率越高,但存活时间可能越短。(2)在出生24小时内给予Balb/c新生鼠腹腔注射30ul 106PFU/ml RRV的方法可成功构建BA模型,重复性好,存活时间长。(3)加味茵陈四逆汤可有效地增加BA小鼠的体重,促进生长发育,减轻黄染,降低肝指数,缓解汇管区炎症细胞聚集,减轻肝脏炎症。(4)加味茵陈四逆汤可降低TβRⅠ,减少TGF-β 1与T β R Ⅰ的结合,间接对T β R Ⅰ磷酸化的过程产生一定的抑制,减少smad3的分泌来延缓BA的进程。(5)由于BA小鼠生存时间较短,暂未观察到collagenⅠ和collagen Ⅲ的沉积和药物疗效。(6)加味茵陈四逆汤可能是通过抑制TIMP1相对表达量,来减少TIMP1与MMP9活性点位的结合,间接使活性的MMP9增多,从而促进ECM的降解。