离子注入真菌α-淀粉酶高产菌选育及固体发酵技术的研究

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本论文根据育种理论和发酵工程理论,对真菌α-淀粉酶生产菌种的诱变选育和固体发酵法生产真菌α-淀粉酶进行了系统的研究。  首先从酒药中分离到一株产α-淀粉酶的真菌,根据形态特征、生理生化指标、18s rDNA和28s rDNA序列分析,将该菌株鉴定为半知菌类(FungiLmperfeetii),丛梗抱目(Moniliales),丛梗抱科(Moniliaeae),曲霉属(Aspergillus),米曲霉(Aspergillus oryzae)。  通过连续的N+注入诱变和高产菌株的定向筛选,获得一株酶活较高的突变株A.oryzae A26f24,产酶活力由137.5μ/g提高到1048.4μ/g。  通过乙醇提取、DEAE sepharose FF阴离子交换和superdex75凝胶过滤分离纯化,得到SDS-PAGE电泳纯的单一α-淀粉酶条带,分子量大约51KDa。通过KI-I2显色反应和酶促产物TLC图谱分析表明:A.oryzae A26f24所产α-淀粉酶水解产物以麦芽低聚糖、麦芽糖为主,为真菌淀粉酶。酶学性质研究结果表明:A.oryzae A26f24所产真菌α-淀粉酶的最适pH为5.5,最适温度为55℃,Km值为5.65mg/mL。1%的浓度下的金属离子Fe2+、Fe3+、K+,Ba2+和Cu2+等对其有抑制作用,Mg2+对其有微量促进作用,而Ca2+对其促进作用较明显。  通过单因素试验、Plackett-Burman实验和响应面分析法,确定了A.oryzaeA26f24菌株锥形瓶固态发酵的最佳产酶培养基组成:玉米粉1.9%(g/g),麸皮32.1%(g/g),蛋白胨2.0%(g/g),黄豆粕6.0%(g/g),复合无机盐1%(g/mL),CaCl21%(g/mL),吐温-802%(g/mL),初始含水率58%(g/g),pH5.5。30℃发酵64h,最佳产酶活力达到1456.08μ/g。  通过曲盘固态发酵放大培养试验,获得了真菌α-淀粉酶固态发酵的最优工艺:初始含水率54.53%,C/N为4∶1、基质厚度3.76 cm、初始pH6.0,接种量为3%,发酵间湿度为85%,在发酵24~60h时间内,每隔10h翻曲一次、30℃培养72h,在该条件下最高发酵酶活为1774.83μ/g。  
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