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第一部分:天然药物橙黄决明素介导血管舒张效应及机制研究 目的:随着社会的发展，天然药物因具有安全，毒副作用小等优势，越来越受到人们的关注，成为一类极为重要的药物开发资源。决明子作为民间降压药物使用已有几百年历史，但具体机制不明。橙黄决明素(Aurantio-Obtusin)为决明子中一种重要的具有生物活性的单体成分。本研究旨在探讨橙黄决明素的舒张血管效应及具体机制。 方法:1.组织浴槽血管张力测定确定橙黄决明素对大鼠肺动脉(PulmonaryArtery, PA)和肠系膜动脉(Mesenteric Artery, MA)血管的作用。2.利用抑制剂筛选橙黄决明素舒张血管的相关机制。3.在原代培养牛主动脉内皮细胞中，Western Blot技术检测相关蛋白的表达水平及活性强度。4.荧光探针检测NO产物的产量。 结果:1.组织浴槽血管张力测定结果显示，橙黄决明素对大鼠离体肠系膜动脉具有浓度依赖舒张效应，而对肺动脉无作用。2.抑制剂筛选结果显示，加入内皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制剂L-NAME及去除内皮后，橙黄决明素对大鼠肠系膜动脉舒张效应明显减小。加入磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY290042后，橙黄决明素对大鼠肠系膜动脉舒张效应也明显减小。3.体外培养的牛主动脉内皮细胞中，应用Western Blot结果显示橙黄决明素可增强细胞中p-eNOS-1177和降低p-eNOS-495活力水平，但不影响总eNOS蛋白表达，加入eNOS抑制剂后，p-eNOS-1177和降低p-eNOS-495活力无变化;并且橙黄决明素可增强细胞中p-Akt-473活力水平，但不影响总Akt蛋白表达，加入PI3K/Akt抑制剂Wortmannin后，p-Akt-473活力无变化。4.荧光探针结果显示，橙黄决明素可增加牛主动脉内皮细胞(Bovine Artery Endothelial Cells，BAECs)中内皮舒张因子一氧化氮(NO)的产物量。 结论:橙黄决明素可通过PI3K/AKT信号通路激活eNOS，增加内皮细胞中NO的含量，进而引起体循环肠系膜动脉的舒张效应。 第二部分:天然药物大蒜素介导血管舒张效应及机制研究 目的:大蒜素是从葱科葱属植物大蒜头中获取的一种天然产物，文献报道大蒜素具有多种药理作用，抗菌消炎、降血压、降胆固醇、抑制肿瘤生长及提高机体免疫力等。本研究针对大蒜素的降血压作用，研究探讨了其对大鼠离体肺动脉(Pulmonary Artery, PA)和肠系膜动脉的血管效应，及具体机制。 方法:1.组织浴槽血管张力测定确定大蒜素对大鼠离体肺动脉（PulmonaryArtery, PA）和肠系膜动脉（Mesenteric Artery, MA）血管的作用。2.利用抑制剂筛选大蒜素舒张血管的相关机制。3.全细胞膜片钳记录所涉及通道的电流变化。 结果:1，组织浴槽血管张力测定结果显示，大蒜素对大鼠肠系膜动脉具有舒张效应，而对肺动脉无作用。 2.抑制剂筛选结果显示，加入内皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制剂L-NAME、去除内皮和加入磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY290042后，大蒜素对大鼠肠系膜动脉舒张效应均无变化。加入蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89和ATP敏感性钾通道（KATP）抑制剂格列苯脲(Glibenclamide，Glib)后，大蒜素对大鼠肠系膜动脉的舒张效应明显减小。 3.急性分离的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞，全细胞膜片钳记录钾电流，结果显示60μ M大蒜素可引起KATP通道开放，钾电流变大，加入KATP通道激活剂吡那地尔(Pinacidil)后钾电流进一步增大，然后加入KATP通道抑制剂格列苯脲后，钾电流变小，最后Bacl2关闭通道。加入PKA抑制剂H-89后，钾电流无变化，大蒜素不再激活KATP通道。 结论:大蒜素可通过cAMP-PKA信号通路激活KATP通道，细胞内钾外流，细胞膜超级化，肠系膜动脉血管舒张。 第三部分:生物活性蛋白HSP70制备 目的:生物活性蛋白，也称生物蛋白。具有多种作用，如提高机体免疫力，促进人体代谢，消炎抗菌抗病毒，降血压降血脂等。热休克蛋白70(Heat shock70 protein，HSP70)是热休克蛋白家族中最重要的一员。可由炎症、损伤等应激因素刺激产生。本研究通过制备有生物活性的HSP70蛋白，以期进一步探讨其在肿瘤、动脉粥样硬化等疾病中的作用及机制。 方法:1.PCR方法扩增得到HSP70基因。2.通过基因重组构建HSP70表达质粒。3.原核宿主菌BL21表达HSP70蛋白。4.纯化所得的HSP70蛋白。 结果:1.PCR结果显示成功扩增得到HSP70基因。2.基因重组得到2种HSP70表达质粒，分别为pET32a-HSP70、pGEX-4T-1-HSP70。3.基因测序结果所构建的HSP70基因无突变。4.琼脂糖凝胶电泳和Western Blot结果显示成功表达HIS-HSP70，GST-HSP70融合蛋白和HSP70真核蛋白。5.纯化结果显示获得了纯度高达90％以上的HSP70蛋白。 结论:成功构建HSP70基因并表达了具有生物活性的HSP70原核和真核蛋白。