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【目的】白质脱髓鞘是空间记忆障碍等认知功能障碍的主要原因之一。本实验以LPC诱导的脱髓鞘为切入点,验证Hv1基因敲除后能否减轻局部脱髓鞘损伤所致的髓鞘结构完整性破坏和空间学习与记忆能力等认知功能损伤。探究Hv1基因敲除是否通过ROS介导小胶质细胞表型向M2型转化通路改善脱髓鞘。【方法】建立溶血卵磷脂(lysophosphatidycholine,LPC)脱髓鞘小鼠模型,模拟单纯脱髓鞘所致的白质损伤,分Hv1基因敲除小鼠与野生型小鼠的Sham组、Hv1基因敲除小鼠与野生型小鼠的LPC诱导脱髓组。(1)运用莫里斯水迷宫(Morris water maze,MWM)行为学检测造模后10天、28天时间点的空间记忆能力损伤在Hv1基因敲除组中是否减轻。(2)在造模后的5、10、28天的时间点处死老鼠,取脑,予以固蓝(LFB)染色观察各组的胼胝体病灶区的髓鞘结构的损伤情况,并予以评分统计分析。(3)通过免疫荧光染色及Western Blot检测观察髓鞘蛋白表达情况。(4)运用免疫荧光技术检测促髓鞘形成的成熟少突胶质细胞、氧化应激的活性氧(reactive oxygen species,ROS)及M1、M2型小胶质细胞的表达情况。(5)在运用免疫荧光技术显示了小胶质细胞的数量激活后,并将荧光显微镜的照片转换为具有代表性的二值和骨架化图像的步骤和Image J插件,并使用Analyze Skeleton(3D)和Graph Pad软件对其进行分析,比较各组小鼠胞体形态改变情况。【结果】1.Hv1基因敲除在LPC诱导脱髓鞘造成的认知功能方面有一定的改善作用。将LPC注射在胼胝体造成局部脱髓鞘的模型成功建立后,继续饲养各组小鼠,并行MWM行为学检测,结果表示在第10天、28天时间点,Hv1基因敲除小鼠的空间记忆能力的认知功能损伤较野生型组轻,且均有统计学意义。说明Hv1基因敲除对脱髓鞘造成的认知功能障碍方面有一定的改善作用。2.Hv1基因敲除在白质损伤,髓鞘碱性蛋白(Myelin Basic Protein,MBP)的髓鞘结构层面,少突胶质细胞(oligodendrocyte,OLG)的髓鞘细胞层面都有一定的改善。在LPC诱导脱髓鞘模型的5、10、28天的时间点,处死小鼠并取脑:(1)LFB染色结果提示在各时间点髓鞘有着自身髓鞘损伤程度的变化,在5天时间点开始脱髓鞘,10天时间点脱髓鞘达高峰,28天开始出现自身疤痕修复,在Hv1基因敲除LPC组比野生型LPC组在10天时间点脱髓鞘改善较多,且在三个时间点的髓鞘损伤程度的改善均有统计学意义。(2)免疫荧光标记MBP结果示Hv1基因敲除LPC小鼠中,在三个时间点的胼胝体病灶区的髓鞘损伤的面积较野生型LPC组小,在10天时间点达最高;使用Western Blot检测MBP的表达量,结果示MBP的表达在28天时间点时在Hv1基因敲除LPC组中含量较野生型LPC组高,提示在髓鞘结构层,Hv1基因敲除对髓鞘结构有一定的保护作用。(3)成熟少突胶质细胞促进髓鞘形成,运用免疫荧光技术标记APC/Olig2,结果示APC/Olig2的比例5、10天的时间点,Hv1基因敲除LPC组的表达较野生型LPC组高,提示在髓鞘形成的细胞层面上Hv1基因敲除也有一定的保护作用。3.Hv1基因敲除通过抑制ROS表达介导小胶质细胞表型向M2型转化,改善脱髓鞘。在LPC诱导脱髓鞘模型建立后的5、10、28天的时间点,处死小鼠并取脑:(1)免疫荧光染色(Iba1)显示病灶区小胶质细胞聚集并激活,但Hv1基因敲除LPC组的小胶质细胞聚集较野生型LPC组少,且在5天有统计学意义;小胶质细胞的激活后胞体面积在28天时,Hv1敲除组较野生型组的小。(2)免疫荧光标记M1型小胶质细胞(CD16/32)与M2型小胶质细胞(CD206)在小胶质细胞(Iba1)中转化的比例来说,在10天时间点,Hv1造模组的M2型转化激活而M1型转化受抑制。(3)在病灶区的ROS(8-OHG标记)经免疫荧光染色后示,Hv1造模组的ROS的比例是较野生造模组的少。以上结果提示在LPC造模后,Hv1基因敲除组通过ROS介导小胶质细胞聚集减少、激活受抑制,并促使小胶质细胞表型向M2型转化。【结论】Hv1基因敲除可以改善LPC诱导的脱髓鞘,其机制可能是Hv1基因敲除后ROS抑制后介导小胶质细胞表型向M2型转化所致。