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脑卒中是一种起病突然的脑血液循环障碍性疾病,具有高发病率、高致死率和高致残率的特点,严重危害人类健康。但是目前临床上对于脑卒中的治疗还不尽如人意。脑缺血/低氧预适应(I/HPC)现象引起的神经保护机制为脑卒中的治疗提供了新的思路。经过二十余年的研究,人们提出了一系列脑I/HPC现象的可能机制,其中包括腺苷及其受体、ATP-敏感钾通道、一氧化氮合成酶、低氧诱导因子、热休克蛋白(HSP)70、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体、超氧化物歧化酶(SOD)和缝隙连接蛋白43等。然而,这些细胞信号分子机制并不能完全解释脑I/HPC的保护效应。值得注意的是,无论上述那种信号转导机制均涉及蛋白激酶C(PKC)的激活,提示PKC介导的信号通路是多种因素作用的共同通路。关于PKC在脑缺血/低氧性损伤和适应中的作用还存在诸多分歧,这与其亚型众多,组织分布各异有关。我们课题组在以往的研究中利用小鼠整体HPC模型、海马脑片氧糖剥夺(OGD)模型和离体细胞低氧模型发现,经典型PKCγ(cPKCγ)的激活可能参与了小鼠脑I/HPC的发生发展过程。然而,cPKCγ及其信号网络蛋白在I/HPC减轻小鼠缺血性脑损伤中的作用还不得而知。因此,在本实验中我们拟进一步借助小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)致局灶性脑缺血模型,探讨cPKCγ在HPC缓解小鼠局灶性脑缺血损伤中的作用。此外,本研究还将进一步利用功能性蛋白质组学的方法,对小鼠大脑皮层组织中与cPKCγ相互作用的蛋白进行分离鉴定,并分析重要的差异信号蛋白在I/HPC缓解继发缺血性脑损伤中的作用。
实验在室温20-22℃下进行,选用成年(12-14w,18-22g)雄性BALB/c小鼠,动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No.80-23)进行。小鼠整体HPC模型和MCAO致小鼠局灶性脑缺血模型按以往报道方法制备。将实验动物随机分为假手术组(Sham)、单纯缺血组(Ischemia)、单纯HPC组(HPC)、HPC后缺血组(HPC+I)和HPC加cPKCγ抑制剂后缺血组(HPC+Go6983+I)。首先,我们利用神经行为学评分、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)凋亡细胞等方法评价HPC和cPKCγ抑制剂对小鼠脑缺血损伤程度的影响。然后,应用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测小鼠脑组织缺血核心区(Ⅰ)、半影区(P)和缺血对侧皮质(C)等脑区中,HPC和cPKCγ抑制剂对cPKCγ及其相互作用蛋白激活及蛋白表达水平的影响。最后,我们利用免疫共沉淀、双向电泳和质谱等蛋白质组学技术分离并鉴定小鼠脑组织中与cPKCγ相互作用的蛋白,并分析其在HPC减轻小鼠缺血性脑损伤的神经保护过程中的作用。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和Bonferroni显著性检验进行统计学处理,并用均数±标准误(X±S.E.)表示,其中p<0.05为显著性差异。实验结果如下:
1.cPKCγ的膜转位激活参与了HPC缓解小鼠局灶性脑缺血损伤过程
我们使用Western blot方法检测了HPC对小鼠皮层缺血核心区,半影区和对侧皮层组织中cPKCγ的膜转位和蛋白表达水平的影响。发现,缺血6 h后小鼠脑组织缺血核心区(I,44.3±112.0％)和半影区(P,52.8±4.1％)内,cPKCγ膜转位水平(激活水平)均明显下降(p<0.05,n=6),而HPC可明显缓解缺血核心区(I,82.2±7.3％)和半影区(P,75.9±2.5％)内MCAO所致cPKCγ膜转位水平的降低(p<0.05,n=6)。然而,对于cPKCγ蛋白表达量的观察发现,缺血6 h后缺血核心区(I,49.3±3.5％)和半影区(P,69.1±1.2％)组织中cPKCγ蛋白水平显著降低(p<0.05,n=6),且不被HPC所缓解。
我们利用神经行为学评分,TUNEL和TTC染色等指标检测了HPC和cPKCγ激活对缺血小鼠神经行为损伤、皮层神经元凋亡以及脑梗死程度的影响。我们发现MCAO致小鼠局灶性缺血6 h后,小鼠的神经行为学功能受到严重损伤,具体表现为活动减少、侧倾、转圈、低反应性、前肢屈曲和运动失调等。与Ischemia组(8.5±0.2)相比,HPC可明显缓解脑缺血小鼠的神经行为损伤(6.5±0.4,p<0.05,n=6)。然而,脑室注射cPKCγ抑制剂Go6983可抑制HPC缓解小鼠行为学损伤的作用(8.9±0.3,p<0.05,n=6)。此外,我们利用TUNEL方法检测了皮层缺血半影区中神经细胞的凋亡情况发现,Ischemia组小鼠皮层半影区内可检测到一定程度的神经细胞凋亡(9.6±1.2％),而HPC+I组半影区凋亡细胞数明显减少(4.5±1.1％,p<0.05,n=3),预先给予cPKCγ抑制剂Go6983可阻断HPC的脑保护作用并使凋亡细胞百分数显著增加(12.4±2.3％,p<0.05,n=3)。TTC染色结果显示,HPC能明显降低Ischemia组小鼠脑组织的梗死体积(26.8±1.0％vs36.3±0.9％,p<0.05,n=10)和水肿率(5.9±0.4％vs11.2±0.5％,p<0.05,n=10)。应用cPKCγ制剂Go6983后,阻断了HPC的保护作用并使梗死体积(36.2±1.3％,p<0.05,n=10)和水肿率(10.1±0.8％,p<0.05,n=10)明显增加。
2.小鼠脑组织内cPKCγ相互作用蛋白的蛋白组学分析
为进一步揭示参与HPC脑保护作用的cPKCγ信号网络,我们应用免疫共沉淀和蛋白质组学技术对小鼠大脑皮层胞浆和膜相关蛋白组分中cPKCγ相互作用蛋白进行了分离和鉴定,结果如下:在正常小鼠脑皮层组织内,共鉴定得到41个与cPKCγ相互作用的蛋白,其中胞浆成分中18个,膜相关成分中37个,两部分共有cPKCγ相互作用蛋白14个。应用PANTHER(Protein ANalysis THroughEvolutionary Relationships)蛋白分类系统,根据分子功能及参与的生理过程对上述蛋白进行分类发现,在两种蛋白组分中,三大代谢相关蛋白、热休克蛋白(HSP)和细胞骨架相关的蛋白如肌动蛋白和微管蛋白等都可能与cPKCγ结合,而只在cPKCγ发生膜转位激活后,才可与泛素蛋白连接酶,半胱氨酸蛋白酶,ATP合酶和G蛋白水解酶等发生相互作用。
利用凝胶分析软件对HPC前后的cPKCγ相互作用蛋白双向电泳图谱进行分析发现,胞浆成分中有8个蛋白点在HPC后发生了明显变化(变化超过1.5倍),其中3个cPKCγ相互作用蛋白水平明显上调,5个下调；膜相关成分中有15个蛋白在HPC后变化明显,其中14个显著上调,1个下调。
为确定双向电泳及质谱鉴定到的蛋白与cPKCγ之间的相互作用,我们使用逆向免疫共沉淀的方法分别验证了突触蛋白、HSP70和HSP60与cPKCγ之间的相互作用。结果提示,在小鼠脑组织胞浆成分和膜相关成分中,cPKCγ都可与突触蛋白及HSP70发生相互作用,由于HSP60只分布于膜相关成分,我们在此组分中也检测到了其与cPKCγ之间的相互作用。
3.cPKCγ澈活对小鼠缺血脑组织中突触蛋白磷酸化水平的影响
我们已经用逆向免疫共沉淀的方法证实了小鼠脑组织中cPKCγ与突触蛋白之间的相互作用。为了进一步探讨HPC以及cPKCγ激活对于突触蛋白磷酸化的影响,我们用Western blot等方法检测了Sham组、Ischemia组、HPC+I组和HPC+Go6983+I组小鼠脑组织缺血核心区、半影区和对侧皮层组织中突触蛋白的磷酸化水平。研究发现,与Sham组突触蛋白磷酸化水平(100％,n=6)相比,Ischemia小鼠缺血核心区突触蛋白的磷酸化水平显著降低(26.1±4.1％,p<0.05,n=6),而HPC可缓解缺血核心区(67.8±5.5％,p<0.05,n=6)和半影区(106.6±10.8 vs Ischemia:87.0±5.0,p<0.05,n=6)中突触蛋白磷酸化水平的降低,这与cPKCγ激活水平的改变一致。此外,预先给予cPKCγ抑制剂Go6983则可以显著抑制HPC缓解小鼠缺血核心区(16.7±2.3％,p<0.05,n=6)和半影区(58.2±7.6,p<0.05,n=6)突触蛋白磷酸化水平降低的作用。
综上,本研究发现cPKCγ的膜转位激活参与了HPC缓解MCAO致小鼠局灶性脑缺血损伤的作用,同时在小鼠脑组织中鉴定出41个与cPKCγ相互作用的可能信号网络蛋白,其中cPKCγ-突触蛋白信号通路可能在HPC缓解小鼠缺血性脑损伤过程中起着至关重要的作用。本研究成果进一步丰富了人们对脑缺血/低氧损伤和适应相关信号转导机制的认识,并为临床寻找防治脑卒中等缺血/低氧性脑损伤药物提供了科学的实验依据。