论文部分内容阅读
棉花黄萎病(Verticilliumwilt)是棉花高产和稳产的主要障碍，大量研究证明海岛棉(Gossypiumbarbadense)中存在抗黄萎病基因，是研究棉花黄萎病的理想材料。选育抗病棉花品种是防治棉花黄萎病的有效措施，但采用传统方法选育抗性品种的工作由于各种原因进展缓慢。当今抗病分子育种中的热点之一是寻找在防御信号传导途径中能激活多种防御成分，提供广谱抗病的转录因子。从整个抗病基因转录调控网络的角度出发，在海岛棉中分离抗病相关的信号传导基因，应用于抗性育种将具有重大的意义。众多研究证明，乙烯在植物抗病反应中起着重要作用。植物乙烯信号传导途径中的转录因子ERF(EthyleneResponsiveelementbindingFactor)，能特异结合很多乙烯诱导表达的病程相关基因(PRPathogenesisReated)启动子中的GCC盒，调控PR基因的表达，在植物抗病防御中扮演着重要角色。为此，我们通过筛选海岛棉(7124品种)接种黄萎病菌(Verticilliumdahliae)前后的根部组织构建的消减杂交文库，克隆到两条海岛棉ERF因。我们希望通过分析和研究这两条海岛棉ERF基因在抗病反应中的功能，为抗黄萎病的棉花分子育种提供有用的候选基因。
这两条海岛棉ERF基因分别命名为GbERF1(GenBankAccessionAY572463)GbERF2(GenBankAccessionAY572462)。GbERF1基因的cDNA全长1399bp，有一个960bp的开放阅读框，预测其编码分子量为36.1kDa，有319个氨基酸，pI4.87的酸性蛋白。通过GenomicWalking的方法，在GbERF1基因组DNA的5端克隆到一段长度为947bp的启动子序列，分析发现其中存在多种与水杨酸和茉莉酸信号途径相关的转录因子结合位点。GbERF2基因cDNA全长1143bp，预测其编码分子量为22.5kDa，有198个氨基酸，pI9.82的碱性蛋白。GbERF2基因有一个长度为515bp的内含子，这在ERF基因中比较罕见。
ERF是植物中庞大的AP2基因家族的一个亚族，其特征是具有一个高度保守的AP2结构域。GbERF1和GbERF2都含有一个与已知ERF蛋白具有很高相似性的AP2结构域，但这个结构域之外的蛋白序列的差别却很大，GbERF1和GbERF2之间也存在较大的差别。通过对已有棉花基因数据的挖掘，我们在棉花中找到了28条编码AP2蛋白的不完整基因序列，其中9条序列编码的蛋白具有完整的AP2结构域。根据所编码蛋白AP2结构域的特征，包括GbERF1和GbERF2在内的这¨条棉花AP2基因可分为DREB和ERF两个亚族。棉花中的AP2基因家族具有与拟南芥和水稻中AP2基因类似的分布，体现了AP2家族基因的原始性。
基因表达分析发现，GbERF1和GbERF2基因在海岛棉中都是组成型表达，但GbERF2基因的表达具有一定的组织特异性。外源乙烯处理和黄萎病菌(V.dahliae)侵染都能诱导GbERF1和GbERF2基因的快速大量表达。水胁迫能抑制GbERF1和GbERF2基因的表达，但GbERF2基因表达的下降出现在水胁迫的前3小时之内，但随后其表达量又恢复到处理前水平；而GbERF1基因表达量的下降出现在水胁迫12小时之后，随后的表达量没有恢复。高盐、低温、干旱等环境胁迫因子刺激以及外源脱落酸(ABA)的处理都能诱导GbERF1基因表达量的明显增加，但对GbERF2基因的表达没有影响，这表明GbERF1不仅响应广泛的外界胁迫，而且可能在ABA和乙烯信号途径的交汇中起着一定的作用。
黄萎病菌侵染能诱导GbERF1和GbERF2基因的快速大量表达，表明这两个基因在海岛棉抵御黄萎病的防御反应中具有一定作用。为了进一步研究这两个基因在抗病方面的功能，我们通过农杆菌介导，把这两个基因分别转入烟草。通过分析这两个基因的超表达对转基因烟草中乙烯诱导抗病相关基因表达的调控，以及由此产生的对转基因烟草抗病性的影响，以探讨这两个基因在植物抗病方面的功能。
转基因烟草分析的结果表明，GbERF1和GbERF2基因的超表达对转基因烟草中内源乙烯的含量没有影响，不改变转基因烟草的表型，而且转基因烟草T1代种子的萌发过程也不会出现乙烯三级效应。我们对10条启动子中含有GCC盒并且和烟草抗性相关标志的PR基因以及4条启动子中不含有GCC盒的乙烯诱导基因进行的基因表达谱分析发现：和野生型烟草相比，在GbERF1和GbERF2的超表达的转基因烟草中，9条启动子中具有GCC盒的PR基因的组成型表达发生了不同程度的增加或减少，并且4条启动子中没有GCC盒的乙烯诱导基因的组成型表达也发生了改变，只有CHN50基因在转基因烟草中的表达量没有发生变化。在这13条表达发生变化的乙烯诱导基因中，有9条基因的表达变化在GbERF1和GbERF2超表达的转基因烟草中是相同，而有4条基因在两种转基因烟草中表现出相反的表达变化。通过调控这些乙烯诱导基因的表达，GbERF1和GbERF2作为转录因子，在乙烯信号传导途径中的作用得到了体现。
GbERF1的超表达增强了转基因烟草对野火病菌(Pseudomonassyringaepvtabac)的抗性，而且抗性的增强幅度和GbERF1的组成型表达水平有一定的联系。然而，GbERF2在烟草中的超表达没有增强转基因烟草对野火病菌的抗性，相反却在相同的条件下一定程度上降低了烟草对野火病菌的抗性。我们对转基因烟草中PR基因转录水平的变化和烟草抗性之间的联系进行了分析，PR3和Chitinase基因在GbERF1和GbERF2超表达转基因烟草中的表达差异可能是转基因烟草对野火病菌抗性改变的原因。
GbERF1和GbERF2是首次在海岛棉中克隆到的ERF转录因子基因，它们在海岛棉中能通过转录水平的变化，参与海岛棉对疾病相关的刺激的响应；作为乙烯信号传导途径中的转录因子，它们在烟草中的超表达能调控转基因烟草中乙烯诱导基因的表达，并通过对PR基因转录水平的调控影响转基因烟草对病菌的抗性。特别值得一提的是，GbERF1基因的超表达不改变转基因烟草的表型，它的表达增强转基因烟草的对野火病菌的抗性，在抗病植物分子育种中将具有一定的实际应用价值。