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低功率激光照射(low-power laser irradiation,LPLI)可以引发多种细胞的增殖或分化,而相对高剂量的激光照射可以引起细胞凋亡。高通量低能量激光照射(High fluence low-power laser irradiation,HF-LPLI)是一种新发现的刺激因子,它能够活化细胞的内源线粒体凋亡途径而导致细胞凋亡。但HF-LPLI诱导细胞凋亡的分子机制尚未研究清楚。Stat3(Signal transducer and activator oftranscription3)蛋白作为细胞的一种重要的转录因子,在促进细胞增殖和抵抗细胞凋亡中起着非常重要的作用。本文的目的在于研究离体细胞在HF-LPLI刺激下细胞内的分子信号事件,主要考察了HF-LPLI处理后在非洲绿猴肾细胞(Africangreen monkey SV40-transformed kidney fibroblast cells,COS-7)中转录因子Stat3的活性变化,Stat3的激活对细胞凋亡的影响,Stat3激活的上游激酶以及Star3激活与激光照射产生的活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的关系,从而探讨HF-LPLI诱导细胞凋亡可能存在的分子机制。
我们首先检测了HF-LPLI刺激后Stat3蛋白活性的变化。利用荧光标记质粒Stat3-YFP和Stat3酪氨酸705位磷酸化抗体,分别采用细胞内实时检测(real-timesingle-cell analysis)技术和Western Blotting技术,我们检测了HF-LPLI处理后Stat3-YFP(yellow fluorescent protein)的核转位和Star3酪氨酸705位磷酸化水平的上升。结果显示Stat3在HF-LPLI处理条件下发生核转位,且酪氨酸705位的磷酸化水平以时间和激光剂量依赖的方式增加。二者均说明HF-LPLI刺激条件下Stat3被激活。
在证实了Stat3被激活后,我们试图发现Stat3的激活对HF-LPLI诱导的细胞凋亡的影响。由于Stat3是一种重要的促增殖和抗凋亡转录因子,因而我们推测Stat3的激活对HF-LPLI诱导的细胞凋亡起抑制作用。我们利用了Stat3的显性负效应(dominant negative,DN)质粒DN Stat3(Y705F)和Stat3的组成性活化质粒(constitutively active form of Stat3,Stat3C),采用细胞内实时检测技术和流式细胞术(Flow Cytometry,FCM),证明了DN-Stat3(Y705F)可以缩短HF-LPLI诱导的CFP-Bax(cyan fluorescent protein)的聚集时间并提高细胞的凋亡率,而Stat3C则可以降低细胞的凋亡率,从而证明了Stat3的激活对HF-LPLI诱导的凋亡起抑制作用。
由于Src在多种生长因子和细胞因子刺激下可以激活Stat3,我们试图证明Src在HF-LPLI刺激条件下是Stat3的上游激酶。我们利用了Src的抑制剂PP1和显性负效应质粒DN-Src分别对细胞进行处理后,检测Stat3酪氨酸705位的磷酸化水平。结果表明,在HF-LPLI刺激后,PP1可以很大程度地抑制Stat3的核转位和酪氨酸705位磷酸化水平的提高,与此同时,DN-Src也可以抑制705位磷酸化水平的提高,从而证明了Src是Stat3激活的主要上游激酶。
我们以前的实验证明了HF-LPLI刺激下ROS大量产生,我们试图找出ROS产生和Stat3激活的关系。利用抗氧化剂维生素C(Vitamin C)处理细胞后,Stat3的核转位和705位磷酸化水平的提高被完全抑制,证明了ROS的产生对于Stat3的激活是必需的。
综合实验结果,本文证明了ROS/Src/Stat3信号通路的激活抑制了HF-LPLI诱导的细胞凋亡,这是一种典型的负反馈抑制(Negative feedback inhibition)机制。本文的结果对于HF-LPLI诱导细胞凋亡分子机制的研究做出了新的探索,同时也对Stat3的功能研究做出了新的贡献。