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禽流感病毒(AIV)是一种人畜共患传染病的病原体,影响着全球人类的所有经济和健康问题。大多数禽流感病毒亚型很少甚至不能引起水禽患病,但家禽中爆发禽流感与死亡率高密切相关。虽然禽流感病毒很少传播给人类,该病毒经过突变或重组后具有引发危及生命的感染能力。新的流感病毒株的不断出现,使预测其表现、传播、毒力或人与人之间的传播潜力颇具挑战性。由于很难预测哪些病毒株或什么位置突变将引起下一次流感大流行,所以很难提前做好准备。疫苗接种能够起到有效预防作用,因此研究新型疫苗尤为重要。流感重组腺病毒疫苗能够刺激机体产生较高水平的体液免疫和细胞免疫,且重组腺病毒载体具有稳定性好、安全性高和宿主范围广等优点,近年来受到人们广泛的关注,具有良好的发展前景。生物反应器微载体培养技术由于其培养表面积大、易于对细胞进行实时检测和控制,在疫苗生产领域被广泛应用。阴离子交换层析具有灵敏度高、选择性好、分离速度快等优点,分子筛层析具有操作条件温和、对于高分子物质分离效果好等优点,目前这两种层析纯化方法较为常用。本实验室构建了以季节性流感H5亚型和大流行性流感H1亚型HA(HA1)基因为主,以禽流感H1、H7和H9亚型HA抗原Th表位及M1表位为表达盒的重组腺病毒疫苗。通过7L生物反应器微载体培养系统对H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒进行大量培养,将发酵产物处理后,采用阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化,鉴定正确后,进行安全性评价试验。生物反应器培养HEK-293细胞,经过多次优化试验,确定培养参数为:温度:37℃、pH:6.9、搅拌速率:30r/min、溶氧:50%、CO2浓度:5%。培养24h后,85%以上细胞贴壁微载体,24-36h细胞增长率较高,48h更换培养液,84h细胞总数增长了4倍,之后细胞生长呈现下降趋势。利用生物反应器微载体培养技术大量扩增H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒,当HEK-293细胞长满微载体表面80-90%时,以5MOI接种H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒,48h后收取病毒液,处理后测得病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL。利用生物反应器培养的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒的病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL,经过阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化后,病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL,两步纯化的回收率分别为30.8%和89.3%,总回收率为27.5%,对纯化后的样品进行PCR鉴定,结果表明基因未丢失。检测260nm和280nm处吸光值OD260/OD280=1.25,符合纯度要求。将发酵和纯化后的重组腺病毒进行小鼠免疫实验研究和安全性评价。研究结果表明,经过两步纯化后的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗能够刺激机小鼠产生特异性抗体及细胞免疫应答,且两步纯化疫苗组的细胞因子水平高于其他疫苗组。安全性评价试验结果表明,两步纯化的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗的安全性良好。总之,本实验初步证明了生物反应器微载体培养系统扩增的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗,经阴离子交换层析和分子筛层析纯化后,能使小鼠产生体液免疫和细胞免疫,具有一定的保护性作用。