中国林蛙蛙皮肽的精制及其抗菌、抗癌生物活性的研究

• 作 者: 刘红玉
• 机 构: 哈尔滨医科大学
• 出 处: 哈尔滨医科大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 药用动物 中国林蛙 林蛙蛙皮

本研究确定了中国林蛙蛙皮肽的分离纯化方法，并对其抗菌活性、抗菌谱、抗癌活性和抗菌、抗癌机理进行了研究和鉴定，为将中国林蛙蛙皮肽开发成食品防腐剂、抗菌和抗癌药物提供了前期基础。主要结论如下：
一、提取中国林蛙蛙皮肽的最佳工艺条件：甲醇浓度80％、液固比为6、提取时间24小时，提取次数3次。
二、确定了中国林蛙蛙皮肽的分离纯化路线。
三、通过HPLC鉴定该蛙皮肽的纯度达到了色谱级。
四、测定该蛙皮肽的等电点为8.5，分子量为5.96ku。
五、应用纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(Nano-ESI-Ms/Ms)技术，对该蛙皮肽酶解后随机选择的片段进行质谱分析，得到3个肽段的氨基酸序列：
肽段1：Tyr-Asn-Val-Leu-Pro-Glu-Leu-Asn-Ser-Arg肽段2：Gin-Pro-Val-Leu-Pro-Tyr-Pro-Lys肽段3：Tyr-Glu-Pro-Val-Arg-Phe-Arg六、该蛙皮肽抗菌谱较广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌和一些临床致病菌都有抗菌效果，且溶血活性低。
七、该蛙皮肽的抗菌活性具有很强的热稳定性，在酸性条件下抗菌活性强，当pH大于8时丧失抗菌活性。对经蛙皮肽处理的枯草杆菌作电镜扫描检查，发现细菌细胞壁出现破损或穿孔，而对照组细菌无细胞壁破损或穿孔现象，表明中国林蛙蛙皮肽的抗菌机制是通过破坏细菌细胞壁，使细胞质外流而致细菌死亡。八、该蛙皮肽对人胃癌细胞SGC-7901的生长有显著的抑制作用。细胞形态学观察，蛙皮肽组中，细胞数量减少，细胞膜出现孔洞，浮起的死细胞增加。MTT实验中随着蛙皮肽浓度增加，作用时间延长，细胞增殖速度减慢，呈剂量-效应关系和时间-效应关系。分裂指数和集落形成实验中，中国林蛙蛙皮肽对人胃癌细胞SGC-7901有丝分裂和集落形成均有显著抑制作用(P<0.01)。
九、通过荧光染色、彗星实验和透射电镜观察，发现该蛙皮肽在低剂量时可诱导SGC-7901人胃癌细胞发生凋亡。透射电镜观察，当蛙皮肽浓度较大时，则通过攻击胞膜，造成膜穿孔来发挥其杀死SGC-7901人胃癌细胞作用。
十、SGC-7901人胃癌细胞中bcl-2和c-myc这两种凋亡调控基因参与了该蛙皮肽诱导SGC-7901人胃癌细胞凋亡的信号传导途径。