应用AdMax系统构建人蛋白激酶Cβ重组腺病毒载体的实验研究

• 作 者: 段炼
• 机 构: 重庆医科大学
• 出 处: 重庆医科大学
• 发表日期: 2008年12期
• 关键词: 蛋白激酶Cβ2基因

第一部分人蛋白激酶Cβ2基因开放读码框的克隆及序列分析
目的：克隆人蛋白激酶Cβ2基因(PRKCBl)的开放读码框(ORF)，为其进一步的功能研究提供基础。
方法：采用逆转录-巢式PCR法，从人脐静脉内皮细胞株中扩增出含PRKCBl基因ORF全长的片段，所得片段经加“A”处理并插入T载体。经蓝白筛选，用特异引物扩增阳性重组子，得到编码人蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)基因的ORF，并与T载体相连，测序鉴定。
结果：通过巢式RT-PCR及T/A克隆获取了PRKCB1基因的ORF，测序结果与GenBank报道序列一致。
结论：成功克隆了PRKCB1基因的ORF，在技术路线上可以为某些难克隆的基因提供参考。
第二部分携带增强绿色荧光蛋白基因的人 PRKCB1真核表达载体的构建及转染
目的：构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞。
方法：从已构建且测序正确的pMD18-T-PRKCB1质粒中，扩增出人PRKCB1并与带有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化，所获重组体酶切鉴定及测序。按优化的转染参数，将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞，荧光显微镜观察荧光蛋白表达，随机视野下计算转染效率。
结果：构建的pReceiver-M29-PRKCB1质粒测序与 GenBank公布的序列一致。转染后48小时，荧光蛋白表达最佳，转染率为18.62％。
结论：成功构建了pReceiver-M29-PRKCB1真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞，观察到绿色荧光蛋白表达，为筛选稳定表达人蛋白激酶Cβ2的内皮细胞株，及其蛋白复合体分离提供分子工具。
第三部分应用Cre/IoxP系统构建人蛋白激酶Cβ2重组腺病毒载体及鉴定
目的：构建人蛋白激酶 Cβ2重组腺病毒载体，为蛋白组学研究提供分子工具。
方法：从pMD18-T-PRKCB1质粒中，扩增出人PRKCB1。所得片段定向克隆至穿梭质粒pDC315上，然后与骨架质粒pBHG10x△E1，3Cre共转染293细胞，经同源重组构建腺病毒Ad-PRKCB1，测定重组病毒的滴度，通过免疫细胞化学和RT-PCR方法进行鉴定。
结果：酶切及PCR表明目的基因正确插入穿梭质粒。同源重组后，倒置显微镜下可见细胞病变效应，病毒包装成功。扩增纯化后病毒滴度为7.9×10°IU/ml。RNA及蛋白质水平鉴定显示目的片段有效表达。
结论：成功构建了含人蛋白激酶Cβ2重组腺病毒载体，为进一步研究其功能奠定基础。