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由大豆疫霉所引起的大豆根腐病严重影响着大豆的产量,甚至导致颗粒无收,威胁着全球的大豆粮食安全,每年在全世界范围内直接造成将近20亿美元的经济损失。大豆疫霉隶属于卵菌,虽然生长形态上与真菌类似,但在进化上与褐藻和硅藻等藻类亲缘关系较近,属于茸鞭生物界,这种差别使得疫霉菌与真菌在结构特征、代谢途径及侵染机制上存在很多差异,导致常规杀菌剂的使用对疫霉病害并不能形成长期有效的病害控制。因此开展疫霉菌致病分子机理的研究,是发展大豆疫病防控新策略与新技术的重要基础,对保障我国大豆生产具有重要意义。高通量测序技术的不断发展以及成本的逐渐降低让越来越多的病原菌基因组测序工作得以完成,推动了植物病原菌致病机理研究的进步。通过对多种植物病原卵菌进行全基因组测序发现,疫霉菌的一个显著特征是基因组中含有数百个效应子编码基因,它们在疫霉菌侵染寄主的过程中发挥了非常重要的作用,可以通过多种机制破坏植物抗病性,从而促进疫霉菌的侵染。因此,探究效应子的进化变异以及其转录调控的机制能够帮助我们深入认识疫霉菌并且为疫霉菌防控新药剂的开发提供候选靶标。本研究通过大豆疫霉比较基因组和比较转录组的分析,对大豆疫霉编码的效应子基因的序列变异特征、结构基础以及不同时空维度的转录多态性进行了研究。此外,本研究还利用转录组学鉴定了调控效应子转录的候选转录因子和长链非编码RNA。主要研究研究内容如下:大豆疫霉4个生理小种的比较基因组分析。我们对代表大豆疫霉主要基因型的四个生理小种的基因组序列进行了比较,它们在全基因组序列、基因序列和非基因序列的相似度分别大于99.688%、99.864%和98.981%。我们一共鉴定了 153个正向选择基因和139个纯化选择基因。在这两种不同类别的基因中,受到正向选择的基因与相邻基因的距离更远,主要位于基因稀疏区内;它们的功能往往未知并且具有较高的序列多态性;它们的转录水平偏低但是在侵染阶段诱导上调表达。更多的分泌蛋白基因特别是效应子基因受到正向选择,其中RxLR效应子承受了更强的正向选择压力。除此之外,我们还对基因的存在/缺失多态性进行了研究。该研究对大豆疫霉四个主要生理小种的基因组变异进行了分析,并且对受到进化选择压力的基因进行了特征的描述。研究结果进一步证明了大豆疫霉基因组进化的“双速率”现象(two-speed genome),并将为植物病原卵菌中新型毒性因子的鉴定提供线索。疫霉菌RxLR效应子二级结构的分析及其与序列变异的关系。我们对卵菌中的RxLR效应子蛋白质二级结构进行了预测,发现绝大多数RxLR效应子C端无论是否含有W/Y/L序列元件,都富含短的α螺旋结构。鉴于在目前进行大规模的蛋白质晶体结构解析还十分困难,我们的研究结果扩展了我们对卵菌RxLR效应子家族蛋白质二级结构的认识。除此之外,我们从其它一些在之前的研究中未发现含有RxLR效应子的病原卵菌和真菌的分泌蛋白中只鉴定到了很少的富含α螺旋结构的蛋白,说明这些物种很可能不含有RxLR效应子。因此,我们的研究结果为以后RxLR效应子进化及功能机制的研究提供了新的理论依据。大豆疫霉侵染大豆不同组织的转录组分析。疫霉菌能够侵染不同的植物组织,引起毁灭性的病害。植物的不同物质在组成结构、代谢过程和防卫反应上相差甚远,关于病原菌如何进行转录调控从而对不同组织进行侵染还知之甚少。大豆疫霉是大豆根腐及茎腐病的病原物,除此之外它还能侵染大豆的叶片等多种组织。在本章研究中,我们对大豆疫霉侵染大豆根部和叶片的转录组数据进行了比较,鉴定到了 642个大豆疫霉基因在不同组织间差异表达。这些基因编码的蛋白显著富集在碳水化合物水解酶、分泌蛋白、氧化还原相关蛋白以及转运因子等功能家族中,推测这些基因与病原菌应对大豆不同组织的细胞结构和防卫反应紧密相关。我们还发现大豆疫霉中接近一半的水平转移基因家族具有组织特异表达模式。我们利用CRISPR/Cas9将其中一个在根部特异性转录的bZIP转录因子编码基因PsBZPc29进行敲除,对转化子的致病性进行测定之后发现,转化子在大豆根部的致病能力显著下降而在大豆叶片上的致病能力不受影响。本章研究结果说明植物病原卵菌通过调控不同类型的基因促进其组织特异侵染,并且其中一个bZIP转录因子可能扮演着重要的调控角色。大豆疫霉中长链非编码RNA的鉴定及分析。长链非编码RNA(lncRNAs)广泛存在于哺乳动物、植物和真菌中,并且在很多重要的生物学过程中扮演着转录调控的角色。但是目前关于植物病原卵菌中lncRNAs的研究还相对较少。在本章研究中,我们利用链特异转录组测序的方法对大豆疫霉多个阶段的样品进行分析,从大豆疫霉基因组中鉴定到了 940个lncRNAs,共含有1010个转录本。通过对鉴定到的lncRNAs进行分析发现,大豆疫霉中的lncRNAs与编码蛋白的基因相比转录本的长度更短、外显子的长度更长、外显子的数量更少,GC含量更低,并且具有较高的最小自由能。通过和其它卵菌以及大豆疫霉小种的基因组进行比较发现,大豆疫霉lncRNAs的序列保守性稍差,具有丰富的序列多态性。结合转录组数据可以看出大豆疫霉lncRNAs具有明显的阶段特异转录模式,并通过半定量PCR的方法对其中具有代表性的lncRNAs进行了验证。进一步的研究发现大豆疫霉lncRNAs在基因组中主要位于基因稀疏区,很多lncRNAs与分泌蛋白编码基因相关,并且这些lncRNAs的相邻基因编码多种类型的效应子。通过转录组数据的分析证明了这些lncRNAs与其相邻基因具有显著的相关性。除此之外,我们还利用大豆疫霉侵染不同组织的转录组数据对lncRNAs进行了研究,发现大豆疫霉编码的lncRNAs还具有组织特异的转录模式。综上所述,我们推测大豆疫霉中的lncRNAs与效应子的转录调控具有潜在的关系。小结:我们利用高通量测序技术和生物信息学手段对大豆疫霉的基因组和转录组进行了深入的研究,发现大量分泌蛋白基因尤其是效应子基因的序列存在丰富的多态性,受到了强烈的正向选择,并且通过对RxLR效应子的蛋白质二级结构进行预测,发现了效应子序列变异的结构基础。通过比较大豆疫霉侵染大豆不同组织的转录组数据,鉴定了一系列组织特异表达基因,并且利用转录组数据我们还鉴定了大豆疫霉的长链非编码RNA,它们可能调控了效应子基因的转录。