聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯介导的细胞凋亡研究及其修饰的聚乳酸膜在原位基因转染中的应用

• 作 者: 江婷婷
• 机 构: 南京大学
• 出 处: 南京大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 聚乳酸 二甲氨基甲基丙烯酸乙酯 表面修饰 紫外聚合 线粒体通路 细胞凋亡 原位基因转染

通过紫外聚合将二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)修饰导PLLA膜上，形成DMAEMA—PLLA膜。DMAEMA分子的正电性可使DMAEMA—PLLA膜与带负电的质粒DNA分子结合，形成DNA—DMAEMA—PLLA膜。傅里叶变换衰减全反射红外光谱和X射线光电子能谱显示DMAEMA与PLLA膜的紫外偶联及DNA与DMAEMA—PLLA膜静电结合都是高效的。通过凝胶过滤层析检测交联于PLLA膜上pDMAEMA分子量。酸性橙染色结果表明交联于PLLA膜上的DMAEMA的量随着紫外交联时间的增加而增加并达到某一饱和值。吸附于DMAEMA—PLLA膜上的DNA浓度与DMAEMA的交联浓度呈正比。将L929细胞种植于修饰后的膜上，观察细胞的形态变化，发现L929细胞在DMAEMA—PLLA膜上也不能正常黏附并伸展，而且在培养一定时间段后开始死亡；而在DNA—DMAEMA—PLLA膜上，L929细胞能够黏附并伸展，且生长速度与空白对照一样。溴化二甲基噻唑基二苯基四氮唑(MTT)法检测膜的细胞毒性结果表明DMAEMA—PLLA膜对L929细胞具有较为明显的毒性，而DNA—DMAEMA—PLLA膜的细胞毒性明显减少，可能是由于质粒DNA的负电中和DMAEMA—PLLA膜表面的正电，降低了膜的细胞毒性。用DNA—DMAEMA—PLLA膜上培养细胞后检测其转染效率，发现DMAEMA—PLLA膜能够促进质粒DNA进入细胞并表达，即DMAEMA—PLLA膜能够提高质粒DNA对细胞的转染效率，这个结果以前的文献中还没有报道过。因此，DMAEMA—PLLA膜是一种既能控制细胞形态、又能有效促进原位基因转染的组织工程材料。
作为阳离子聚合物，聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(pDMAEMA)可用于DNA的包裹和细胞转染实验。然而，pDMAEMA有很强的细胞毒性且其分子机理仍然不清楚。因此，我们分别合成了低分子量的pDMAEMA(2.1KD)和高分子量的pDMAEMA(33KD)，研究他们对Hela细胞毒性的分子机制。从MTT实验结果可以看出，分子量越大，其细胞毒性也越大。为了进一步了解其毒性的分子机制，我们做了一下实验：Hoechst 33258染色；FITC—Annexin V和PI双染；caspase 3酶的活性检测及RT—PCR检测BCL-2蛋白的表达等。实验结果表明pDMAEMA可以明显改变Hela细胞的形态并使其DNA浓缩和片断化。并且pDMAEMA处理过的Hela细胞有明显的磷脂酰丝氨酸(PS)外翻现象，并且随着pDMAEMA浓度的增大，PS外翻的细胞量也增多。此外，pDMAEMA还会导致细胞内凋亡关键酶caspase 3蛋白表达量的增加。随着pDMAEMA量的增大，caspase 3蛋白的表达量越多。RT—PCR结果显示pDMAEMA会使Hela细胞BCL-2基因的表达以聚合物浓度依赖的方式减少。以上结果表明：高低两种分子量的pDMAEMA都能通过线粒体通路介导Hela细胞的凋亡，并且高分子量的pDMAEMA导致的凋亡现象比低分子量的明显。