论文部分内容阅读
蜘蛛丝（Spider Silk）是一种机械性能优越的生物材料，具有很多潜在应用。目前研究主要集中在圆网蜘蛛品种分泌的六种蜘蛛丝蛋白纤维，它们各自在蜘蛛整个生命中起着不同的重要作用。主壶腹腺丝（MaSp）主要用于构建蜘蛛网落核心框架，具有优良的机械强度和生物亲和性，这种性能优异的生物材料在军工、航天及医学工程领域具有很巨大的发展前景。 蜘蛛具有同类残食特性且偏爱独居，纺丝量少于家蚕，所以无法通过高密度饲养来大规模获取蛛丝纤维，这限制了蜘蛛丝纤维在现代工业上的应用。随着生物科技技术的发展，科学家们逐渐通过基因工程的方法制备人造蛛丝；近几年来，国内外研究所集中于重组蛛丝纤维的仿生制备，但是获得的人造蛛丝纤维无法与天然蛛丝相媲美。 多年研究显示，蛛丝纤维人工仿生制备进度缓慢难题之一是很难获得蜘蛛丝蛋白质全长编码序列。蛛丝纤维蛋白质编码框大、重复率高及高含量GC等，应用普通PCR和cNDA文库构建技术很难获取全长编码序列，目前报道仅有三种蛛丝蛋白质全长基因序列。大腹园蛛（Araneus ventricosus）是中国分布很广的蜘蛛种类之一，主壶腹腺丝作为一种生物材料，除了少量短的cDNA序列外，其表达和仿生都缺乏实验数据论证。本文基于前期构建成功的A.ventricosus fosmid基因组文库和STS/3D-PCR技术筛选鉴定 MaSp全长编码序列。根据已公布的A.ventricosus MaSp部分氨基酸序列，设计并合成MaSp1非重复区3'端的简并引物并进行PCR扩增。产物经测序分析证明为MaSp1C端（~200bp）非重复区部分编码序列，以此确定为MaSp的STS（Sequence tagged site）序列，并以此设计了2对特异性引物用于大腹园蛛Fosmid基因组文库的STS/3D-PCR筛选。将1042块384-well plates分成约26批次（每批次40块384-well plates），构建一级混合池（Primary pools）、二级混合池（Secondary pools）和超级池（Super pools）。利用特异性引物多混合池进行PCR扩增筛选，得到含有MaSp1编码基因序列的阳性克隆AvMaSp1-34-1-B10。 通过本文实验研究，利用STS/3D-PCR技术特异性引物对Fosmid基因组文库进行筛选，获得了携带大腹园蛛MaSp1编码基因的阳性克隆，经测序获得了A.ventricosus MaSp基因新序列，丰富了大腹园蛛蛛丝纤维基因编码序列数据，为研究仿生制备人造蛛丝奠定了良好的基础。 本文第二部分的研究是为探索蛛丝蛋白质模块单元在成丝过程中的作用，研究了大腹园蛛MiSp R1R2CT功能模块在不同pH条件下的纤维化动力学特性.将大腹园蛛MiSp蛋白质序列中的R1R2CT功能模块与硫氧还蛋白质构建成Trx-R1R2CT融合蛋白质，该融合蛋白质含有凝血酶的酶切位点。将重组体Trx-R1R2CT在BL21(DE3)中进行表达，表达产物经分离纯化和凝血酶酶切后，表达量约为15 mg/L LB培养基。纯化的R1R2CT蛋白质在pH7.5和6.5时较为稳定，在22 h之内不发生纤维化；当pH值降至5.5时，R1R2CT在前2 h内快速纤维化，3～5h趋势较为平缓；5 h之后R1R2CT蛋白质再次出现ThT信号的快速增长，7 h后保持缓慢增长至22 h。R1R2CT的增长速率及幅度高于单独的CT蛋白质质，而单独的R1R2在pH7.5，6.5和5.5时均保持稳定，表明重复区可增强CT纤维化趋势。已有研究表明，CT在重复区纤维化过程中起晶核作用，本实验结果也从反面证实CT的晶核理论。