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本文从以下三部分进行了阐述。 第一部分 人类胚胎细胞培养体系与心肌特异性启动子报告系统的建立。 人类胚胎干细胞系源自体外受精胚胎发育至囊胚期的内细胞团，可以在体外保持长期的自我更新。由于其具有可以分化为内，中，外三个胚层衍生的所有细胞的能力，因此在研究胚胎早期命运决定、遗传性疾病、新药开发以及再生医学方面具有极其重大的意义。尽管十几年来hESCs的培养体系不断的发展并优化，但是建立稳定的人类胚胎干细胞培养体系对任何是个实验室来说仍然是一项异常艰巨而又非常关键的工作，也是后续深入研究的先决条件。 为了建立标准化的人类胚胎干细胞培养体系，并为后继的心肌定向分化研究打下坚实基础，我们建立了稳定的、标准化的人类胚胎干细胞培养体系。我们以小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层细胞建立了H9(WA09)和H1(WA01)两株人类胚胎干细胞系的饲养层培养体系;由于饲养层培养体系会为后续的研究和应用带来诸多问题，我们又采用Matrigel为基质，mTeSR1为培养基建立了无饲养层培养体系。两种培养体系下人类胚胎干细胞均可以稳定传代30代以上（4-5个月），且核型正常。用碱性磷酸酶染色(ALP)和免疫荧光技术检测多能性标记物来鉴定细胞的未分化状态，碱性磷酸酶染色阳性，多种多能性标记物均为阳性。类胚体分化模型证明这两株细胞系可以分化出内，中，外三个胚层细胞类型，并可以分化出能够跳动的心肌细胞。 心脏病是世界上发病率和致死率最高的疾病之一，人类胚胎干细胞为研究心脏病的发病机制和治疗方法提供了理想的模型。考虑到细胞治疗的应用研究的需求，为了更好的示踪分化出来的心肌细胞，建立心肌特异性启动子的报告系统尤为重要。我们将人类心肌特异性蛋白α-actin的增强子元件与心肌蛋白troponin-Ⅰ启动子的一段序列与绿色荧光蛋白EGFP连接（EnAct TNNI-EGFP）构建到慢病毒载体上，同时构建了心肌特异性的钠钙交换蛋白1(sodium-calcium exchanger1， NCX1)启动子驱动绿色荧光蛋白EGFP(NCX1-EGFP)的慢病毒载体，慢病毒转染人类胚胎干细胞后用puromycin筛选得到了阳性克隆。核型正常。用类胚体分化的方法诱导hESCs分化为心肌细胞，采用荧光显微镜观察跳动区域，报告系统所表达的绿色荧光蛋白与类胚体心肌细胞的跳动区域一致。 综上所述，我们在本实验室成功建立了无饲养层/无血清、稳定的标准化人类胚胎干细胞系的培养体系，人类胚胎干细胞系在这种培养体系下可以分化得到功能性心肌细胞。我们建立了人类胚胎干细胞心肌特异性启动子EnAct_ TNNI报告系统和NCX1报告系统，这为研究人类胚胎干细胞心肌细胞分化的调控和人类胚胎干细胞应用于细胞治疗的研究提供了有用的工具。 第二部分 TRF3在人类胚胎干细胞中内胚层命运决定中的作用研究。 TRF3(TATA-box-binding protein(TBP)-related factor3)，也被称作TBP2，是TBP家族中脊椎动物特异性成员，C端的DNA结合结构域和TBP高度同源。TRF3在发育进程中不同时间点表达丰度差异很大，在小鼠和人类不同组织中有丰度差异很大的表达。之前的研究表明TRF3作为一个通用转录因子，参与调控非洲爪蟾、斑马鱼、小鼠早期胚胎发育等很多重要的发育进程。但由于巨大的种属差异性，人类的发育调控要远比小鼠和斑马鱼复杂，很多调控机制在种属间存在着很大的差异。TRF3在人类早期胚胎发育过程中的具体功能仍然未知。所以TRF3在人类胚胎早期发育中的功能不能按照已有的动物模型推测，而是有待深入研究。 为了明确TRF3在人类胚胎发育过程中具体功能，我们选择人类胚胎干细胞作为研究人类胚胎早期发育调控的模型，来揭示TRF3在人类胚胎早期胚胎发育过程中的作用。 之前研究显示TRF3在人类中胚层和内胚层来源的组织中，例如心脏，肾脏，肺等，表达丰度较高，这提示TRF3可能参与了中内胚层的调控。通过人类胚胎干细胞中内胚层分化过程中TRF3的表达谱分析，我们发现TRF3在中内胚层分化的过程中逐渐上升。显示TRF3可能在人类胚胎干细胞中内胚层的分化过程中具有重要的生物学功能。 为了明确TRF3在中内胚层分化过程中的具体功能，我们通过慢病毒系统进行基因操作，将TRF3的shRNA序列用慢病毒转染人类胚胎干细胞，筛选出有沉默效应的稳转人类胚胎干细胞系。通过碱性磷酸酶染色和免疫荧光检测多能性标志物Oct4、Tra-1-60、SSEA4鉴定knock-down细胞系的多能性，发现TRF3并不影响人类胚胎干细胞的自我更新。细胞周期分析显示knock-down细胞系的周期也未受到影响。采用中内胚层分化模型诱导人类胚胎干细胞向中内胚层分化，通过Realtime-PCR和Western免疫印迹分析检测TRF3对hESCs中内胚层分化的作用，结果显示人类胚胎干细胞的中内胚层分化受到抑制，而且中内胚层衍生的中胚层和内胚层分化也受到抑制。 综上所述，TRF3的knock-down不影响人类胚胎干细胞的自我更新，但是抑制了人类胚胎干细胞的中内胚层的分化，继而抑制了中胚层和内胚层的分化，表明TRF3参与了人类胚胎干细胞中内胚层分化的调控。 第三部分 人类多能性干细胞衍生的多能心血管前体细胞的高效诱导和自我更新。 心脏的发育涉及中胚层，多能心血管前体细胞的程序性诱导以及功能的成熟。人类多能性干细胞，包括人类胚胎干细胞和诱导多能性干细胞，为心脏发育和心脏再生医学的研究提供了理想的模型。多能心血管前体细胞由人类多能性干细胞分化而来，能够分化成为多种心脏细胞谱系，并且没有致瘤性，从而为心肌再生提供了一个极具吸引力的细胞来源。但是，高效转化人类多能性干细胞成为均一的多能心血管前体细胞仍然充满挑战，分化效率仅有10-60％;心血管前体细胞也无法自我更新，多能心血管前体细胞的自我更新与分化决定的分子机制也知之甚少。 为了解决这些问题，建立简单且可重复的，不需要经过细胞分选而在无滋养层细胞/无血清的条件下高效转化人类多能性干细胞成均一的多能心血管前体细胞，并且在无滋养层细胞/无血清的条件下可以稳定扩增多能心血管前体细胞，使其长期自我更新并保持分化成为心血管谱系主要细胞类型能力的方法尤为关键。 我们联合加入BMP4， AA和GSK3抑制剂CHIR99021(CHIR)，可以高效地将未分化的人类多能性干细胞转换成表达人类多能心血管前体细胞标志物MESP1和SSEA1的细胞类群。多能心血管前体细胞在含有GSK3抑制剂CHIR和另外两种从化合物库中筛选出的小分子化合物的培养基中，可以稳定地自我更新并保持多能心血管前体细胞标记物MESP1的高水平表达。通过畸胎瘤实验发现，和人类多能性干细胞相比，无论是新鲜分离的还是长期扩增后多能心血管前体细胞致瘤性都要低。在不同谱系分化的条件下，采用流式细胞术，结合免疫荧光分析以及RT-PCR检测多能心血管前体细胞向三个主要心血管谱系分化的能力，结果显示即使经过长期体外扩增，多能心血管前体细胞依然保持了向心血管谱系的体外分化能力。 综上所述，我们建立了一种能够高效诱导人类多能性干细胞得到多能心血管前体细胞并且可以稳定扩增多能心血管前体细胞的系统。这些多能心血管前体细胞分子标记均一，在特定条件下能够在体外长期自我更新，并保持向心血管系统主要谱系分化的能力，而且无致瘤性。此系统为揭示心血管谱系特化过程中的分子事件提供了独特的平台，并为药物测试，新药创制，以及细胞替代疗法以提供了高纯度的无成瘤性的细胞来源。