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莽草酸(shikimic acid,SA),芳香氨基酸生物通路-莽草酸途径的重要中间产物,具有众多生理功能：作为传统中药具有抗炎和镇痛作用,是抗病毒和抗癌药物合成的重要中间体,能抑制血小板聚集而阻止血栓的形成,有广泛的药用价值。同时莽草酸还是合成神经氨酸酶抑制剂GS4104的原料,用于治疗和预防H5N1型禽流感(商品名达菲),随着禽流感疫情在全球蔓延,莽草酸将更加供不应求。
目前莽草酸生产主要从八角属植物果实中提取,工艺繁琐,成本较高,而化学合成则反应复杂,产品收率低,在大规模工业生产中的应用受到影响,本课题拟构建高产莽草酸的大肠杆菌基因工程菌,实现莽草酸的生物发酵,为大规模工业化生产莽草酸提供简单及经济的工艺。
本工作利用温度敏感性质粒在大肠杆菌JM83染色体上敲除了编码莽草酸激酶的aroL基因,构建了灭活株JDL02,部分阻断了莽草酸向3-磷酸莽草酸转化,实现了莽草酸在发酵液中的积累。同时从大肠杆菌JM83染色体上分别克隆得到了PEP合成酶编码基因ppsA、转酮醇酶编码基因tktA和3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶编码基因aroG,其中ppsA和tktA的编码产物分别催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖(E4P)的形成,两者在aroG编码的产物的作用下缩合形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP),而DAHP是莽草酸途径中第一个中间产物。对获得的三个基因分别构建了单表达及串联表达的多种表达质粒,并将其导入JDL02,得到的一系列的重组菌进行摇瓶发酵。产物分析显示,重组菌莽草酸产量均有不同程度的提高,在等生物量情况下,JDL02/pTrc-aroG-tktA产量是出发菌株JM83的18.35倍,其摇瓶产量达94.3mg/L。尝试发酵罐水平培养该重组菌,其莽草酸产量在26h时达到最高为85.2mg/L。