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目的迄今为止化疗仍然是恶性淋巴瘤全身治疗的主要手段之一,但是化疗过程中不可避免地伴随着严重毒副作用的发生,从而限制了其在临床工作中的有效应用。因此,为了降低抗肿瘤药物的毒副作用,提高药物的主动靶向性,增强药物的抗肿瘤疗效,我们构建了一种以介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)为载体的控释靶向性药物投递系统,即Rituximab修饰的荷载细胞毒性药物盐酸多柔比星(DOX)的MSNs纳米粒子(RDMSNs)。该靶向性药物投递系统既能特异性靶向B细胞淋巴瘤细胞膜受体又能在细胞内的弱酸性环境中释放药物发挥抗肿瘤作用。我们运用RDMSNs靶向性药物投递系统治疗B细胞淋巴瘤,评价其抗肿瘤疗效,探讨其抗肿瘤的作用机制。方法1.RDMSNs靶向性药物投递系统的构建和表征:首先通过共聚法合成了羧基修饰的MSNs纳米粒子,并以其作为药物载体负载抗肿瘤药物DOX,构建细胞内pH值响应性的药物投递系统。在此基础上,为了进一步优化纳米粒子,我们将Amine-PEG2000-Biotin修饰到MSNs纳米粒子母核表面,最后通过生物素-亲和素桥接方法连接B细胞淋巴瘤细胞膜表面高表达的CD20受体靶向的配体Rituximab,构成靶向肿瘤细胞的RDMSNs靶向性纳米粒子。分别通过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱仪、激光粒度分析仪、紫外分光光度计等仪器对所制备的纳米粒子进行物理表征,计算纳米粒子的包封率和载药率,抗体的链接效率;通过体外透析实验了解载药纳米粒在不同pH值的条件下释药特性。2. RDMSNs的细胞靶向性评价及体外细胞毒性研究:分别采用CD20+的Raji细胞和CD20-的Jurkat细胞验证RDMSNs纳米粒子的靶向性性能;并使用流式细胞仪(FCM)、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和TEM检测和观察细胞内的DOX荧光强度和纳米粒子分布和数量。为了验证RDMSNs纳米粒子的细胞靶向性性能及体外细胞毒性效应,分别以CD20+的Raji和Daudi细胞株及CD20-的Jurkat细胞株为体外研究模型,采用CCK-8法评估载药纳米粒子的细胞毒效应。并且通过CLSM观察不同纳米粒子作用于细胞后细胞凋亡时核的形态学变化,FCM评价不同纳米粒子作用于细胞后的细胞凋亡率。3. RDMSNs对Raji细胞淋巴瘤的治疗疗效及体内荧光成像研究:构建Raji细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,当肿瘤体积达到100mm3左右时,将荷瘤裸鼠随机分为4组:Saline组,Free DOX组,DMSNs组和RDMSNs组,每组5只,按照2.0mg/kg尾静脉注射给药,4天给一次药,连续4次,探讨载药纳米粒子的抗肿瘤疗效,并测定肿瘤生长体积及体重,计算抑瘤率,取各组裸鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏行H&E染色检查观察药物的安全性。采用TUNEL法检测各组肿瘤组织细胞的凋亡情况,免疫组织化学染色后,观察肿瘤细胞凋亡相关蛋白Bax、caspase-3、Bcl-2及增殖细胞相关的核抗原Ki67的表达。此外,还采用近红外活体成像方法评价Cy5.5-DMSNs和Cy5.5-RDMSNs纳米粒子对B细胞淋巴瘤的靶向性性能。结果1.成功构建了结构明确的MSN-COOH纳米粒子,以其作为载体制备RDMSNs靶向性纳米粒子。SEM和TEM显示纳米粒子大小一致和形态规则,傅里叶变换红外光谱仪证实羧基基团被成功连接;RDMSNs靶向性载药纳米粒子的粒径和zeta电位分别是56.3±11.2 nm和-31.5±5.2 mv; RDMSNs靶向性纳米粒子DOX的载药率和包封率分别是(23.5±4.7)%和(45.2±6.2)%;抗体Rituximab的连接率为(66.2±4.1)%;体外药物释放实验显示在pH 5.0的条件下药物释放率明显高于pH 7.4的条件(P<0.05),提示RDMSNs靶向性纳米粒子具有pH值响应性的释药特性。2. Raji和Jurkat细胞株分别与RDMSNs靶向性纳米粒子孵育2h后,FCM检测细胞内DOX荧光强度发现Raji细胞株中的荧光强度大约是Jurkat细胞株的三倍(P<0.01),同样在CLSM下观察到Raji细胞株中的荧光强度明显高于Jurkat细胞株,通过TEM也观察到类似的结果。在Raji、Daudi和Jurkat细胞株中,RDMSNs靶向性纳米粒子对Raji和Daudi细胞株的细胞毒性效应高于DMSNs组和FreeDOX组(P<0.05),且其细胞毒性效应呈现浓度依赖性。而DMSNs和RDMSNs对Jurkat细胞株的细胞毒性效应无差异。在细胞凋亡实验中,CLSM观察到RDMSNs组具有凋亡细胞核形态学变化的细胞株明显多于其他治疗组。FCM检测显示24h对照组,MSNs组,FreeDOX组,DMSNs 组和 RDMSNs 组 Raji 细胞凋亡率分别是(3.0± 0.4) %,(3.9 ±0.6) %,(18.2 ± 1.2) %, (10.1 ± 1.2) % 和(23.3 ± 1.4) %, RDMSNs 组凋亡率明显高于其他组(P<0.05)。且RDMSNs组凋亡率呈现浓度依赖性(P<0.01)。3.在RDMSNs纳米粒子抗肿瘤疗效评估实验中,Saline组、Free DOX组和DMSNs组的平均肿瘤体积分别是 623.5±156.9mm3, 481.2±55.2mm3 和 335.6±57.3mm3,而RDMSNs处理组的平均肿瘤体积是98.0±51.8 mm3,与其他三组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。Saline组、RDMSNs组和DMSNs组裸鼠平均体重分别是25.2±0.9g、22.4±0.5g和21.6±0.5g,而Free DOX处理组的平均肿瘤体积是18.1±0.6g,与其他三组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。Free DOX组,DMSNs组和RDMSNs组的肿瘤抑制率分别为(22.79±4.37)%, (46.22±6.03)%和(84.28±5.92)%,RDMSNs 组的肿瘤抑制率最高,RDMSNs组分别与Free DOX组和DMSNs组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。这些结果表明RDMSNs组抗肿瘤作用最强且毒副作用较小。Free DOX组裸鼠的心脏H&E染色显示心肌纤维排列紊乱,而Saline组,RDMSNs组和DMSNs组裸鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏H&E染色显示未见明显病理学改变,表明载药纳米粒子在体内具有良好的生物安全性。在TUNEL染色实验中,RDMSNs组肿瘤组织中绿色荧光最多,凋亡细胞数量最多。肿瘤组织免疫组化染色结果显示,与Saline组和Free DOX组相比,Bax和caspase-3蛋白在DMSNs组和RDMSNs组中表达量明显增加,而Bcl-2蛋白和Ki67抗原表达量明显减少,并且在RDMSNs组中Bax和caspase-3蛋白表达最强,Bcl-2蛋白和Ki67抗原表达最弱,表明RDMSNs靶向性纳米粒子具有较强的诱导细胞凋亡能力和抗细胞增殖能力。在近红外活体成像实验中,24h时间点Cy5.5-RDMSNs靶向组荧光信号最强,主要聚集于肿瘤区域,此后,随着时间延长荧光信号逐渐减弱。Cy5.5-DMSNs非靶向组具有类似的活体成像结果,但荧光信号半定量分析发现6h后肿瘤区域的荧光信号强度较Cy5.5-RDMSNs靶向组弱(P<0.05)。结论1. RDMSNs靶向性纳米粒子结构完整、形态均一、载药量高,其结构中的PEG成分及表面修饰的Rituximab使载药纳米粒子具备了靶向性给药的性能,并且具有pH值响应性的控释药物性能。2. RDMSNs靶向性纳米粒子能够被淋巴瘤B细胞特异性的内吞,是通过受体介导的内吞作用进入淋巴瘤B细胞内。RDMSNs靶向性纳米粒子在细胞内所形成的溶酶体或核内体的酸性环境中能够促进药物释放,增加了细跑内化疗药物的累积,从而发挥了增强的细胞毒性效应和较高的诱导细胞凋亡能力。3. RDMSNs靶向性纳米粒子具有特异性的靶向性功能和增强的抗肿瘤活性,较低的毒副作用,较强的凋亡诱导能力。控释靶向性药物投递系统RDMSNs有可能成为化疗药物的载体,将药物靶向于淋巴瘤B细胞,提高化疗药物的疗效,减轻化疗药物的毒副反应,为B细胞淋巴瘤的靶向治疗提供了一个崭新平台。