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氨基酸是无血清培养基中的重要组成部分,其种类和浓度配比对免疫细胞增殖和活化具有重要意义。为此,本文以自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK-92)为对象,探究NK-92细胞体外扩增与氨基酸代谢之间的关系,从氨基酸的角度对无血清培养基进行理性设计与优化。首先在自主设计的成分简单且明确的无血清培养基SFM-MIN中分析了培养过程中NK-92细胞的氨基酸代谢特性,根据氨基酸的比消耗速率将谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸和精氨酸初步确定为影响NK-92细胞体外扩增的关键氨基酸,并通过正交实验确定4种氨基酸的最适浓度分别为13.00、0.40、1.15和0.70 mmol/l。将SFM-MIN中上述4种氨基酸的浓度调至最适水平后将其命名为SFM-OPT,以商业化无血清培养基为对照评价SFM-OPT对NK-92细胞的扩增效果。结果发现体外培养10 d后,SFM-OPT中的总细胞扩增倍数以及培养物中的CD3-CD56+细胞比例分别为164.06±35.94倍和(88.70±1.47)%,显著高于对照组中的 54.25±12.14 倍和(69.83±3.11)%(p<0.05);而在两种无血清培养基中扩增的NK-92细胞对K562细胞的杀伤活性相当。可见,优化了氨基酸浓度的SFM-OPT培养基可更有效的促进NK-92细胞的体外扩增且不影响其功能。进一步在SFM-OPT中改变谷氨酰胺的浓度以考察关键氨基酸谷氨酰胺对NK-92细胞扩增的影响。结果发现,将SFM-OPT中谷氨酰胺浓度提高到13.00 mmol/1培养10 d后,细胞的扩增倍数和培养物中CD3-CD56+细胞比例分别为161.87±21.02倍和(91.23±1.33)%,显著高于对照组 SFM-OPT 的 55.55±7.00 倍和(73.23±0.85)%(p<0.05);扩增的NK-92细胞对K562细胞的杀伤活性、CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达量也均明显地优于对照组(p<0.05);同时NK-92细胞中的凋亡比例和胞内ROS水平明显降低f<0.05);胞内GSH/GSSG和NADPH/NADP+显著提高(p<0.05)。可见,提高谷氨酰胺浓度可更好的维持了细胞胞内氧化还原状态,降低胞内ROS水平,从而促进NK-92细胞的体外扩增以及增强其杀伤活性。最后,鉴于NK-92细胞是一类高能耗代谢支持细胞,因此以SFM-MIN为基础考察丙酮酸钠和谷氨酰胺这两种能量物质对NK-92细胞体外扩增的影响并通过正交实验确定其最适浓度分别为2.50和13.00 mmol/l,并在商业化有/无血清培养基中将丙酮酸钠和谷氨酰胺浓度提高至上述水平对该结果进行验证。结果发现培养15 d后,在有血清培养体系中,NK-92细胞的总细胞扩增倍数可达到3712.85±225.74倍,显著高于对照组中的2255.93±243.00倍(p<0.05),且两组培养条件下CD3-CD56+细胞比例基本不变,但其对K562细胞杀伤活性均值由57.23%提高到63.53%;在无血清培养基T009中,NK-92细胞的扩增倍数和CD3-CD56+细胞比例分别为3193.59±199.99倍和(90.37±0.90)%,均明显高于对照组中的1917.16±242.87倍和(82.68±2.28)%(p<0.05),其对K562细胞杀伤活性均值由63.53%提高到71.22%。可见,提高丙酮酸钠和谷氨酰胺的浓度可促进NK-92细胞的扩增且增强其杀伤活性。