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东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）是我国东海海域最主要的赤潮原因种之一。东海原甲藻赤潮以其高频率、大规模和持续时间长已引起了科研人员的广泛关注，但目前大多研究主要集中在生理生态、生活史及形态分类的探讨，而有关东海原甲藻赤潮生消机制的分子生物学研究却较少。溶解无机磷是东海原甲藻磷源的直接来源，然而对赤潮爆发地调查的资料显示，当赤潮爆发时海水中溶解无机磷含量并不高。故本课题通过模拟无机磷限制条件，来研究东海原甲藻响应无机磷胁迫的分子机制。 本课题利用抑制性差减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）构建了无机磷胁迫与非胁迫条件下东海原甲藻差异性表达基因的cDNA文库，拟在分子水平上探讨东海原甲藻响应无机磷胁迫的分子机制。分别以F/2-Si（对照组）和不添加无机磷元素的F/2-Si（实验组）培养基培养藻细胞，并于处理后的8 h、12 h、24 h和48 h收集藻细胞，提取总mRNA构建SSH-cDNA文库，把总mRNA反转录成cDNA加上接头后进行两轮差减杂交和两轮抑制性巢式PCR，最后将第二轮巢式PCR产物通过T–A克隆的方法与pMD?18–T Vector载体连接并转化到DH5α大肠杆菌中，随机挑选480个单克隆进行菌落PCR鉴定获得463个阳性克隆。进而通过商业量测序得到444个基因序列。用Contig Express软件出去引物及载体序列后在GenBank数据库中进行BlastX/BlastN比对分析，共鉴定出134个有效ESTs，根据参与的生物过程及分子功能，可将这些基因分成11大类，即：（1）细胞防卫和内稳态基因（3.73％）；（2）蛋白质代谢相关基因（20.15%）；（3）应激反应相关基因（5.22%）；（4）细胞骨架和结构蛋白（6.72%）；（5）DNA代谢和修复相关基因（0.75%）；（6）未分类或位置功能的基因（26.87%）；（7）参与信号通路基因（6.72%）；（8）细胞代谢相关基因（20.90%）；（9）转录和翻译调控相关基因（2.24%）；（10）磷代谢相关基因（3.00%）；（11）细胞周期相关基因（3.73%）。 为进一步验证所构建的差减文库是否代表差异表达的基因，分别选定与细胞代谢和应激反应相关的出5个基因，即NAD-dependent deacetylase、Extracellular sulfatase Sulf-1、Heat shock protein90、Heat shock protein70和Heat shock pr otein40作为考察对象，应用荧光定量PCR考察对照组和实验组中东海原甲藻基因的差异表达情况。结果显示：5个基因都有不同程度的差异性表达，其中除了H eat shock protein70以外其余4个基因经无机磷胁迫处理后表达量均上调，经配对T-检测NAD-dependent deacetylase、Extracellular sulfatase Sulf-1和Heat shock protein40处理前后表达量在统计学上有显著差异（P<0.05）。可见，本实验构建的SSH-cDNA文库基本代表差异表达的基因。