人胸腺素α原基因的克隆表达及其生物活性的初步研究

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Goldstein等于1966年自小牛胸腺中首次提取到具有免疫调节活性的物质,并命名为胸腺素。其后经过30余年的临床研究,一些胸腺激素或胸腺肽制剂已作为一种免疫调节剂类药物广泛应用于临床,在治疗或减轻原发性免疫缺陷、病毒或细菌感染、自身免疫和癌症等疾病方面取得了较好的疗效。目前临床上所用的胸腺素主要是由小牛胸腺中纯化得到的胸腺素F5组分(TF5),其中含有40余种肽类,相对分子质量为1000-15000Da。胸腺素α原(ProTα)的N端含有完整的胸腺素α1(Tα1)28肽。ProTα具有与Tα1相似甚或更高的免疫调节活性。由于在免疫和细胞生长调控方面的广泛作用,ProTα在其被发现后的20多年里,一直作为胸腺素家族中的研究重点而备受人们的关注。 本实验从中国人外周血中提取总RNA,反转录为cDNA,以其为模板,设计引物,利用PCR技术扩增出ProTα基因,将成熟ProTα的编码框序列构建到原核表达载体pGEX 6P-1中,在氨苄青霉素平板上筛选抗性转化子,并经PCR,双酶切鉴定,挑选出阳性克隆子,DNA测序正确,表明成功地构建了原核表达载体pGEX-α。将重组载体pGEX-α化宿主菌BL21(DE3),异丙基-β-D-半乳糖(IPTG)诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE分析鉴定目的蛋白,分析发现与预期外源目的基因表达产物相当的37KD左右增加了一条特异蛋白条带,且目的蛋白是以可溶的形式表达,凝胶成像仪分析其表达量高达27.9%。用亲和层析分离纯化后的ProTα融合蛋白作为抗原,与完全弗氏佐剂完全乳化,采用腋下多点注射免疫的方法免疫新西兰大白兔,经过31天的免疫,获得兔抗ProTα的多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,测得抗体效价超过l:51200,蛋白印迹分析结果显示,该抗体能特异性与ProTα原产生明显免疫亲和反应。体内抗肿瘤实验显示,该融合蛋白在1.0-0.0001μg/只范围都具有明显抑制S180在小鼠皮下的生长,尤其对已经腹水接种S180细胞的荷瘤小鼠再皮下注射重组融合蛋白,0.0001μg/只的浓度并具有显著延长小鼠寿命的效果,尤其是1μg只浓度以上的剂量即可达到超过60天,并且完全存活的效果。在抗氧化能力活性检测中,选择4个月龄,体重在40克以上的老龄老鼠进行实验,通过注射重组融合蛋白,不仅可以显著提高老鼠的胸腺指数,同时可以显著提高老鼠抗氧化能力。本研究采用GST原核表达系统克隆表达融合蛋白ProTa,制备了兔抗ProTa多克隆抗体,所制备的抗体具有很强的灵敏性和特异性,初步探索重组ProTa的抗肿瘤,抗氧化及延长荷瘤小鼠寿命等生物活性,获得具有生物活性的ProTa融合蛋白,为进一步研究开发ProTa的生物药品奠定了基础。
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