黄鳝FTZ-F1克隆、表达和功能分析及cyp19a1a上游调控因子的筛选

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ftz—f1是核受体超家族的一员,编码孤核受体FTZ—F1。目前已经发现了很多它的同源基因。研究证明它在类固醇生成、性别分化过程中都发挥着重要的作用。 本实验室前期已从黄鳝性腺cDNA文库中获得了两个ftz—f1的同源基因,eff1a中间片段和5片段以及eff1b全长序列。在此基础上,本文克隆了eff1a3片段,发现了eff1a的一种剪接形式eff1a—s,并对这三种形式的FTZ—F1的表达和功能进行了分析。 eff1a cDNA全长为1892bp,具有211bp的5UTR和223bp的3UTR,编码框为1458bp,编码486个氨基酸的蛋白质;而eff1b cDNA全长为1689bp,具有89bp的5UTR和202bp的3UTR,其编码框为1398bp,编码466个氨基酸的蛋白质。eff1a的一种选择性剪切形式eff1a—s cDNA全长为1505bp,具有211bp的5UTR和292bp的3UTR,编码框为1002bp,编码334个氨基酸的蛋白质,是eff1a的C末端缺失的形式,缺少配体结合区及AF2功能域。这种缺失形式在斑马鱼的zff1a中也发现过。 序列分析表明这个两个基因具有孤核受体家族的典型结构,并且具有FTZ—F1家族特有的FTZ—F1box。进化树分析表明eFF1a属于FTZ—F1家族的NR5A4亚家族,与尼罗罗非鱼的SF-1相似性最高;eFF1b与斜带石斑鱼的ftz—f1和斑马鱼的zFF1d最接近,同属于NR5A4亚家族。 采用RT—PCR的方法检测eff1a,eff1a—s和eff1b在雌性和雄性黄鳝各组织的表达情况,结果显示: 1) eff1a在雌性中表达广泛,在卵巢和胰脏中高表达,其次是下丘脑和脾脏,在视项盖—丘脑、延髓、垂体、心脏、肝脏、血液、和眼睛有微弱表达;在雄性的垂体、精巢和脾脏高表达,在下丘脑和胰脏检测到有表达,其他组织未检测到表达; 2) eff1a—s在雌性的卵巢和脾脏中表达,垂体和胰脏微量表达;在雄性的精巢和胰脏检测到表达,下丘脑中微量表达; 3) eff1b在雌性中只在垂体和卵巢中检测到表达;在雄性的垂体和精巢高度表达,其次是下丘脑、胰脏和心脏,在视顶盖—丘脑有微量表达,未在其他组织检测到。 本文构建了eff1a、eff1a—S和eff1b的pcDNA3.0真核表达载体,研究eFF1a、eFF1a—S和eFF1b对黄鳝cyp19ala启动子的作用,结果表明:在小鼠睾丸支持细胞TM4中,eFF1a和eFF1b都能刺激黄鳝卵巢芳香化酶(cyp19ala)启动子的转录;eFF1a—S可以抑制eFF1a和eFF1b对黄鳝cyp19ala启动子的转录激活作用。 在性逆转过程中,cyp19ala的表达一直下降。为了找到调控cyp19ala表达的转录调节因子,本文对应用寡核苷酸偶联磁珠沉淀法筛选cyp19ala上游调控因子进行了初步探索。针对黄鳝cyp19ala近端启动子,设计一对引物(其中反向引物用生物素标记),扩增位于TATA—box上游约360bp的保守序列,利用生物素与链霉亲和素结合的高度特异性和稳定性使之与包裹有链霉亲和素的磁珠偶联,然后与核蛋白提取物孵育,进行Pull—down实验,质谱鉴定所得蛋白为组蛋白H1。本文的实验并没有发现cyp19ala的特异调节因子,下一步的实验方案有待改进。
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