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黑豆是传统的药用兼食用的农产品资源,在我国全国各地都有广泛的种植。近几年来,天然无害的食用色素开发利用是植物化学和食品科学研究中非常热门的课题。黑豆皮原料易得,价格低廉,适用于工业化生产的需要,黑豆花色苷在食品、医药等领域具有很大的应用前景。黑豆皮花青素是羟基供体,是一种良好的自由基清除剂,能够与金属离子螯合形成花青素-金属复合物,在提高自身稳定性的同时,也促进了人体对金属离子如铁的吸收,具备极好的应用价值和开发潜力。因此,本文以黑豆作为原料,采用超声波技术提取花青素,研究黑豆皮花青素与铁离子[Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)]的相互作用,及其对铁的稳定性和溶解度的影响,对开发新型多功能食品原料以及促进铁的吸收具有重大意义。在超声波辅助条件下,采用pH 1.0的60%酸性乙醇溶液对黑豆皮进行花青素的提取,分别通过pH示差法和高效液相色谱法测定提取液中花青素的含量,pH示差法结果表明黑豆皮中花青素含量为6.915 mg/g,高效液相色谱法结果表明黑豆皮中花青素含量为 6.965 mg/g。在pH 1.0、3.0、5.0和7.3条件下,研究黑豆皮花青素提取液与铁离子[Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)]的非共价相互作用。紫外可见吸收光谱表明pH影响花青素提取液与铁离子的相互作用,在pH 1.0、3.0、5.0和7.3范围内,随着pH的增加,Fe(Ⅱ)对花青素提取液的紫外-可见吸收光谱影响作用逐渐增加,Fe(Ⅲ)对花青素提取液的紫外-可见光谱有明显影响,说明铁离子改变了花青素的羟基结构。荧光淬灭光谱表明,铁离子对花青素的荧光具有淬灭作用,且淬灭作用随着铁离子浓度的增大而增大,说明花青素提取液与铁离子[Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)]发生了相互作用形成了复合物,且不同pH条件下,淬灭率大小有所不同;花青素提取液对稳定Fe(Ⅱ)不被氧化和提高Fe(Ⅲ)溶解度方面具有良好的效果。采用制备型液相色谱对黑豆皮花青素粗提液进行了纯化,精制得到纯度达98%的花青素单品,经质谱鉴定,在正离子模式下,质谱峰显示出现了 m/z为450.3的离子峰和m/z为288.1的离子碎片,表明黑豆皮中花青素的主要成分为矢车菊素-3-葡萄糖苷。利用荧光光谱分析(Fluorescence Spectroscopy)、微量热泳动仪(Micro scale Thermophoresis,MST)研究了矢车菊素-3-葡萄糖苷与铁离子[Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)]相互作用的机制。荧光光谱结果表明:pH 1.0,3.0,5.0和7.3条件下,铁离子对C3G的荧光淬灭作用的分子淬灭常数都高于2.0×1010 per mol/s(动态淬灭的最大值),二者之间的相互作用为静态荧光淬灭过程;不同的pH条件下,铁离子与C3G的结合作用存在差异,Fe(Ⅱ)和C3G在pH1.0,3.0,5.0和7.3条件下,其结合常数和结合位点数的大小顺序均为:pH 1.0pH7.3;而对于Fe(Ⅲ)和 C3G,该顺序则为 pH 1.0>pH 3.0>pH 5.0>pH7.3。MST实验表明,铁离子与C3G的结合过程中ΔG<0,△H<0,ΔS<0,结合过程是放热的、自发进行的。其结合曲线得出的Kd值表征亲和力大小,不同pH条件下结合常数的大小顺序结果与荧光结果一致。在pH 1.0、3.0、5.0和7.3条件下,C3G提高了 Fe(Ⅱ)的稳定性,使 10天内 Fe(Ⅱ)的保留率从88.64%,62.45%,45.15%,40.31%提高到了 94.11%,94.05%,94.18%,90.77%,降低了 Fe(Ⅱ)在储存期间的氧化率;对Fe(Ⅲ)的溶解度有不同程度的提高作用,在pH5.0,5.5,6.0,6.5和 7.0 条件下,矢车菊素-3-葡萄糖苷使Fe(Ⅲ)的溶解度分别从90.01%,63.37%,49.46%,46.87%,34.64%,4.84%增加到 94.30%,79.24%,76.38%,67.06%,62.65%和 9.31%。