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研究目的:1、观察骨痿Ⅰ号方对原发性骨质疏松症肾虚血瘀型患者的临床疗效,探讨该方的组方意义。2、通过实验观察骨痿Ⅰ号方对大鼠骨微观结构的影响,及其对Wnt3a/β-catenin信号通路表达的影响,探索补肾活血药物治疗骨质疏松症的作用机制。研究方法:临床研究:选取在南京中医药大学第二附属医院(江苏省第二中医院)门诊就诊并收治入病房的原发性肾虚血瘀型骨质疏松症确诊患者,经骨密度测定及相关临床检查确诊,且自愿加入临床研究,符合纳入标准者共50例,其中治疗组25例,对照组25例。住院期间检测血生化指标(血清ALP、血钙、血磷)、骨代谢指标(β-CTX、P1NP)及进行证候积分评定,1周后出院,出院后继续口服中药及抗骨质疏松西药,并于用药1周,1月,3月分别复查VAS疼痛评分,用药1月时门诊除复查VAS评分外,还需复查血生化、证候积分,及进行疗效评判,用药3月时复查骨密度及骨代谢指标。实验研究:1、观察骨痿Ⅰ号方对模拟骨质疏松症大鼠外周血生化、骨密度、骨组织形态、骨力学及HE病理学形态的影响。2、以qPCR实验及Western Blotting实验观察骨痿Ⅰ号方对模拟骨质疏松症大鼠骨组织BMP2、Runx2、Opn、Wnt3a mRNA 及蛋白的影响。生物信息学研究:通过网络生物药理学研究方药的分子生物学作用机制,通过分析论证其发挥作用的相关通路。研究结果:临床研究:(1)最终完成病例47例(治疗组24例,对照组23例),治疗前治疗组与对照组的一般资料无明显统计学差异,具有可比性(P≥0.10),两组之间腰背部VAS疼痛评分也无显著的统计学差异(P≥0.05),血生化中血清ALP、血钙、血磷水平无明显统计学差异(P≥0.05),中医肾虚血瘀证候评分比较,无显著性差异(P≥0.05)。(2)治疗后VAS疼痛评分变化:治疗组与对照组治疗后1周时VAS评分均下降不明显(均P≥0.05),1月、3月VAS评分则较治疗前逐渐显著下降(均P≤0.05),且随访时间越久,VAS评分越低。治疗后1周时两组间比较,差异均无明显统计学意义(P≥0.05),而治疗后1月、3月时中药治疗组VAS评分组间差异有统计学意义。(3)治疗后骨密度变化:治疗3月后两组骨密度均较治疗前显著提高(均P≤0.05),而两组间疗效比较,差异均无明显统计学意义(P≥0.05)。(4)治疗后血生化(血清ALP、血钙、血磷水平)变化:血清ALP、血钙、血磷水平均较治疗前有明显升高(P≤0.05),组间比较治疗组血清ALP、血钙、血磷水平治疗后升高水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P≤0.05)。(5)治疗后骨代谢指标(β-CTX、P1NP)变化:治疗3月后骨代谢指标β-CTX均较治疗前显著下降,P1NP较治疗前显著上升(P≤0.01),组间比较中药治疗组β-CTX、P1NP变化程度均显著高于对照组,差异有统计学意义(P≤0.01)。(6)经治疗后两组患者有较好的疗效满意度,有较高的显效有效率,治疗组91.67%,对照组82.61%,两组间比较治疗组显著优于空白组。(7)两组治疗1月后都可改善患者的肾虚血瘀型中医证候评分(P≤0.05),相较而言,治疗组评分改善情况显著优于对照组,两组间有明显统计学差异(P≤0.05)。实验研究:(1)与空白组相比,卵巢切除术后5周的模型组大鼠的骨密度、最大应力以及最大载荷显著降低,骨体积分数BV/TV、骨小梁数量Tb.N、骨小梁厚度Tb.Th也显著下降,骨小梁分离度Tbsp则明显增高,HE病理检测可见大鼠骨骼病变明显,组织结构出现病变,形态不完整;模型组大鼠血清钙,血清磷浓度,肌酐均出现下降,而血清碱性磷酸酶(ALP),血尿素氮(BUN),丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)都呈现上升趋势,且差异有统计学意义,说明骨代谢处于高转换状态,骨质疏松症模型复制成功。(2)骨痿Ⅰ号方对骨质疏松症有显著疗效,各剂量药物组与模型组相比,能显著升高骨密度水平,增加股骨以及腰椎的最大应力以及最大载荷,增加BV/TV、Tb.N、Tb.Th,而血清钙,磷浓度,肌酐出现升高,ALP,BUN,ALT及AST下降,且呈现剂量依赖性。HE病理检测也发现经治疗后的骨骼形态有所改观。(3)骨质疏松模型大鼠骨组织内BMP2、Runx2、Opn与Wnt3a/β-catenin信号通路蛋白水平均比正常空白组大鼠下降,提示骨组织中Wnt3a/β-catenin通路异常与骨质疏松发病存在密切联系。(4)qPCR检测及WB检测均发现BMP2、Runx2、Opn与Wnt3a/β-catenin信号通路蛋白水平上升,提示骨痿Ⅰ号方可通过正向介导促进Wnt3a/β-catenin通路转录,从而促进成骨细胞增殖分化,以达到相应治疗效果。生物信息学研究:发现该复方可通过促进相关高表达蛋白的激活,从而正向促进Wnt通路的激活,与本次研究结论一致。研究结论:骨痿Ⅰ号方可有效缓解原发性骨质疏松症肾虚血瘀型患者的胸腰背部疼痛,升高骨代谢重要指标血清ALP、血钙、血磷水平,改善β-CTX、P1NP水平,经治疗后患者有较好的疗效满意度,并能有效改善患者的肾虚血瘀型中医证候评分,配合常规抗骨质疏松药物治疗,相较于单独西药治疗,效果更加显著,体现该方具有良好的临床疗效,中医药辩证治疗肾虚血瘀型骨质疏松症具有其优势性。而实验发现应用骨痿Ⅰ号方可通过调控Wnt3a/β-catenin信号通路,上调Wnt3a蛋白及BMP2、Runx2、Opn因子,从而促进成骨细胞增殖分化,以达到抗骨质疏松的疗效。生物信息学研究也发现该复方可通过促进相关高表达蛋白Runx2的激活,从而激活Wnt通路,达到抗骨质疏松之效,与本次研究结论一致。