论文部分内容阅读
目的：法舒地尔（Fasudil）是目前临床上最常用的ROCK（Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase）特异性抑制剂，药理作用是通过抑制Rho/ROCK信号通路促使脑血管扩张，在临床上常用于治疗蛛网膜下腔出血以及肺动脉高压等疾病。近几年有报道表明法舒地尔也能够抑制肿瘤的生长，并且ROCK2在人肝癌临床样本中存在普遍高表达的现象，但是法舒地尔是否能够抑制肝癌的生长以及其中的作用机制尚未有明确的结论，ROCK2是否能成为治疗肝癌的潜在靶点也有待研究。因此，本研究中将借助细胞和多种动物模型，分别在体内和体外通过分子生物学的手段研究法舒地尔调控肝癌生长的作用及其分子机制。 方法：本研究首先在人临床肝癌样本中分别用Western blot、免疫组化以及qRT-PCR对ROCK2的mRNA和蛋白表达进行检测。然后检测法舒地尔作用肝癌细胞后细胞的生长情况以及细胞周期进程的改变，并对ROCK下游信号通路中的分子表达进行检测。同时，利用流式细胞术和Western blot对肝癌细胞的凋亡进行检测。接着，利用两种不同的动物肿瘤模型检测法舒地尔在体内对肝癌生长的作用，与体外实验结合共同证明法舒地尔是否能够抑制肝癌的生长。最后，通过表型恢复实验检测肝癌细胞生长的表型、细胞周期的变化以及细胞骨架的组装等是否有所逆转，确定法舒地尔调控肝癌生长作用的机制。 结果：在90%人肝癌临床样本中，发现ROCK2无论在mRNA水平还是蛋白水平均高于正常组织。用ROCK2抑制剂法舒地尔处理肝癌细胞系Hep3B和Huh7后，两种细胞的增殖能力下降，死细胞明显增多，并且ROCK2下游的p-LIMK以及p-cofilin的表达均下调。然后，通过对细胞的周期和凋亡进行检测发现法舒地尔作用后肝癌细胞的周期阻滞在G2/M期，且未出现凋亡。在小鼠原位肝癌模型和小鼠移植瘤模型中也发现法舒地尔抑制肿瘤的形成，并且通过对小鼠肿瘤组织进行免疫组化和Western blot检测均发现法舒地尔在体内也能够抑制肝癌生长并抑制细胞周期进程，同样也不能诱导肝癌细胞发生凋亡。 结论:进一步的研究发现法舒地尔能够引起细胞出现多核及微核等现象，并且法舒地尔作用后细胞骨架组装出现异常，不能形成丝状结构，可能是细胞出现了有丝分裂灾变而死亡。而通过细胞表型恢复实验发现法舒地尔抑制ROCK2后通过抑制cofilin的磷酸化作用促进了cofilin对F-actin的解聚，从而抑制了细胞骨架微丝的组装，进而细胞出现有丝分裂灾变。