【摘 要】
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目的：利用RT-PCR技术制备大鼠胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的cDNA片段，利用基因重组技术将GDNFcDNA克隆到pAdTrack-CMV中，构建GD
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目的：利用RT-PCR技术制备大鼠胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的cDNA片段，利用基因重组技术将GDNFcDNA克隆到pAdTrack-CMV中，构建GDNFcDNA重组腺病毒载体，为后续的缺血性脑损伤基因治疗的研究做准备。
方法：1.从美国国家医学图书馆互联网核酸数据库检索到GDNFcDNA序列，设计GDNF的上、下游引物，预计扩增片段653bp。2.取新生大鼠纹状体组织提取总RNA，紫外分光光度法测定和甲醛琼脂糖凝胶电泳鉴定后，以提取的总RNA为模板，GDNF的上、下游引物做RT-PCR，得到GDNFcDNA，GDNFcDNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序鉴定后，纯化回收，限制性内切酶HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切pAdTrack-CMV(9220bp)及GDNFcDNA，酶切产物纯化后，在T4 DNA连接酶的作用下，将GDNFcDNA定向插入于pAdTrack-CMV的HindⅢ、Kpn Ⅰ酶切位点之间，纯化回收连接产物。3.用氯化钙制备感受态大肠杆菌DH5 α，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5 α后，接种在含有卡那霉素的阳性培养基中大量扩增。取一部分扩增的大肠杆菌DH5 α提取质粒，以提取的质粒为模板，GDNF的特异性上、下游引物做PCR鉴定，并将质粒DNA做限制性内切酶Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ双酶切鉴定；另一部分扩增的大肠杆菌送交测序中心做测序分析。
结论：本实验构建的pAdTrack-CMV-GDNFcDNA真核表达载体，经PCR、酶切鉴定和测序分析证明为目的GDNFcDNA片段，核苷酸序列与GenBank中大鼠GDNFcDNA序列相同，且连接方向正确。
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