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生物进化过程中,为了适应不同的功能需要,演变出多种具有不同结构特征和可以识别并结合ssDNA的蛋白模式,以更好地完成其被赋予的重要使命。目前人们已发现的多个可以结合ssDNA的蛋白质的经典结构域包括OB folds, KH domains, RNA recognition motifs (RRMs), RecA-like domain, whirly domain以及最近刚报道的DrpA domain等等。生命体遗传物质的高保真复制需要染色体的精确配合与调控,该过程中必不可少的是复制体的正确组装,引发体作为复制体在复制起始位点组装的一个亚复合物,其准确组装也受到多种机制调控。引发体由若干蛋白组成,分别是解旋酶,引发酶以及多个相关的辅助衔接蛋白,它们在DNA复制过程中通过以ssDNA为模板合成复制时它们所必需的RNA引物。准确及时地起始引发体的正确组装为正常染色体的复制以及停滞的复制叉重启奠定了基础。DnaT是大肠杆菌引发体蛋白之一,在重启停滞的复制叉过程中发挥着重要作用。作为一个衔接蛋白,DnaT联系着PriA-PriB-ssDNA三元复合物与DnaB/C复合物,介导了完整的PriA依赖的引发体的组装,同时对于完善DNA受到损伤后复制叉重启机制也有着重大的意义。但针对DnaT如何在此过程发挥对应的功能,DnaT蛋白与ssDNA以何种方式结合以及DnaT蛋白与PriB之间相互作用的结构生物学研究尚属于空白。在本研究中,通过X射线晶体学手段,我们解析了蛋白DnaT与单链脱氧核糖核酸片段ssDNA复合物的两种结合状态的三个晶体结构,分辨率分别为1.96A和2.83A以及硒代蛋白晶体2.08A。复合物晶体结构展示DnaT蛋白以一种螺旋纤维状结构盘绕在ssDNA上,DnaT蛋白以一种base-inward的模式结合ssDNA,每个三螺旋束结构域结合两个碱基脱氧核苷酸。通过与同源DnaT蛋白的序列比对发现,DnaT84-153主要通过保守的a2helix识别ssDNA的碱基部分,并通过L3loop以及α3helix稳定蛋白与磷酸骨架的相互作用。同时,DnaT蛋白采用多个结构域协同作用的模式来结合底物ssDNA,以更好完成相应的生物学功能。这种蛋白折叠模式以及以三螺旋束花样结构域结合ssDNA的方式此前均未被报道。因此,该DnaT84-153-dT15ssDNA复合物晶体结构模型揭示了一种新颖的以三螺旋束花样结构域结合ssDNA的模式。鉴于复合物结构中只能观测到降解后的DnaT84-153片段,通过分析不同长度片段的DnaT84-179, DnaT84-153和全长DnaT蛋白对ssDNA结合能力,发现DnaT蛋白的N端和C端对于提高DnaT结合ssDNA的协同性发挥着重要作用。多个结合实验表明DnaT可以结合多种不同序列的ssDNA,没有序列识别特异性。底物结合实验和电镜负染结果显示DnaT可以结合到其生理底物phiX-174ssDNA上形成一种棒状的核蛋白纤维结构,我们推测DnaT在PriA-依赖的引发体组装和重新启动停滞的复制叉过程起到支架的作用,为后续生物学过程提供平台。综合多个实验结果结合和已有的相关文章报道,我们提出一个关于DnaT蛋白在PriA-依赖的引发体组装和复制叉重启过程中如何发挥功能的模型。