【摘 要】
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菠萝（Ananas comosus）是世界四大热带果树之一,其果实结构特殊,属于典型的聚花果,由果芯（果序轴）、果托、苞片、宿存的花萼和不太发育的子房等构成。研究菠萝果实生长发育过程中各组成部分的基因表达特征,对揭示以菠萝为代表的聚花果类型的果实生长发育具有重要的学术意义和参考价值。本论文利用Illumina 2500RNA-Seq测序平台对菠萝苞片、花萼、花瓣、花盘、花托、子房壁、胎座、胚珠、雄
【基金项目】
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国家重点研发计划项目子项目,菠萝组织器官分化相关转录因子的筛选及其调控机制（2018FYD1000504-5）,2018.7-2022.12； 广东省优稀水果产业技术体系项目,种质资源评价与特色品种选育岗位（2016LM1128）,2016.9–2019.8；
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菠萝（Ananas comosus）是世界四大热带果树之一,其果实结构特殊,属于典型的聚花果,由果芯（果序轴）、果托、苞片、宿存的花萼和不太发育的子房等构成。研究菠萝果实生长发育过程中各组成部分的基因表达特征,对揭示以菠萝为代表的聚花果类型的果实生长发育具有重要的学术意义和参考价值。本论文利用Illumina 2500RNA-Seq测序平台对菠萝苞片、花萼、花瓣、花盘、花托、子房壁、胎座、胚珠、雄蕊、花柱、果心、茎、叶、根等器官（或组织）分别进行转录组测序,结合自编流程,通过对果实生长发育基因表达分析、组织特异表达基因挖掘、基因共表达网络和e FP数据库构建等,探讨了菠萝果实生长发育过程中不同组织器官的转录表达谱变化。获得了的主要研究结果如下:1.对菠萝果实生长发育三个阶段（果实膨大起始期、果实快速膨大期和果实膨大结束期）的不同组织器官分别采样,提取RNA和进行转录组测序。总计对36个样本进行测序,获得数据约150 Gb,每个样本具有30 M以上读段。自编流程对菠萝果实转录组数据进行质控并调用STAR软件进行读段回贴。所有样本比对率均在85%以上。使用String Tie软件,基于最大似然法,估计所有菠萝基因的表达量。经统计,本次测序数据覆盖菠萝基因组注释中88.02%（23,789）的基因。每个样本中检测到的基因（FPKM≥1）在18000～20000之间波动。整体测序与表达量估计质量较好,适用于下游分析。2.基于TAU算法,自编流程挖掘菠萝组成型表达基因和器官特异表达基因。获得组成型表达基因273个,其中包括常见q RT-PCR内参基因Actin（Aco011848.1,Aco018482.1）和EF-1α（Aco010306.1）等。这些组成型表达基因集合丰富了菠萝果实生长发育研究中可选的内参基因库。获得不同器官的特异表达基因共计1051个,其中雄蕊特异表达基因最多（286个）,其次是根部特异表达基因（170个）,随后是叶片特异表达基因（147个）。基于超几何分布,对特异表达基因进行富集分析并做功能判断后的结果显示,每个器官对应的特异表达基因与其执行的特定生物学功能明显相关,而这些器官特异表达基因的发现为进一步的菠萝分子育种提供了参考。此外,基于器官特异基因的表达丰度与注释可靠性,筛选了21个可用于后续验证和应用实验的候选基因。3.使用DESeq软件,基于负二项分布,通过对11个组织器官各自在果实生长发育不同阶段的基因表达进行差异显著性分析,共挖掘到7613个差异表达基因。其中,营养器官中的差异表达基因较少,根、茎、叶中的差异表达基因分别为1483、2181、1603个;而生殖器官中的差异表达基因较多,胚珠、胎座、花盘中的差异表达基因分别为2730、2723和2676个。大部分器官的差异表达基因均观测到细胞壁相关活动富集,这可能与这一期间大部分细胞处于快速分裂和生长相关。此外,分析过程中也发现了一些可能有助于进一步解析菠萝果实生长发育相关分子调控网络的线索,如相对于其他器官,花托在果实生长发育过程中,蔗糖合成酶基因表现出持续上调。4.撰写R语言脚本,基于WGCNA算法,构建了菠萝果实生长发育过程中的基因共表达网络。共鉴定基因模块18个,每个模块包含的基因数量从115到4522个不等。在这些模块中,部分模块表现出时空特异表达。基于模块的表达偏好和功能注释,对其主要关联的功能做了判断。其中,Pink、greenyellow和turquoise模块可能与果实膨大初期细胞的快速分裂相关;lightgreen模块可能与果实快速膨大过程中细胞的生长相关;可特别关注的是,lightcyan模块中的基因可能与菠萝果实特殊香气形成相关。5.搭建了首个菠萝器官特异表达基因的可视化e FP数据库。通过自编流程,基于e FP浏览器框架,整理本论文产生的所有表达数据,最终搭建成首个菠萝器官特异表达基因数据库。数据库搭建过程中,应用了docker容器技术,实现了数据库的可移植性和可拓展性。数据库的交互式网页上,首次提供了直观查看菠萝基因在不同器官上表达变化的接口,方便了用户进行菠萝果实生长发育相关基因表达探索。同时,数据库也提供了文本下载接口,可供用户做进一步的数据利用,为分析研究菠萝基因的表达模式提供直观便捷的分析平台,有助于推动菠萝果实生长发育相关特征分子机制的深入研究。综上所述,本文通过形态观察、器官拆分和转录组分析等技术,探讨了菠萝果实生长发育过程中的基因表达谱变化。同时,还通过构建菠萝器官特异表达基因网页数据库,以用户友好的方式对外共享了本工作所得数据,至今已获得近1000人次访问量,为菠萝果实生长发育分子生物学研究工作提供了较为丰富的数据和理论参考。
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