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通过分析PI3K抑制剂沃曼青霉素(wortmannin)化学结构，并根据已有的文献报道，化学家推测出其激酶抑制活性基团，并在此基础合成出一系列的α-亚甲基Y-内酯吲哚类化合物。选用简单、快速、重复性好的的磺酰罗丹明B实验检测此系列化合物作用于肿瘤细胞产生的细胞增殖抑制效应；选用Western印迹法直接观察PI3K-Akt-mTOR通路相关信号分子磷酸化水平的变化，由此得到这一系列活性化合物对于该信号通路的抑制信息并分析其构效关系。研究发现保有Y位的内脂环不被取代是保证激酶活性的重要条件。经过一系列的筛选和活性测定比较，本文作者得到抑制能力出众的S9(二氢-5-((6-甲氧基甲氧基-2-苯基-1H-吲哚-1-基)甲基)-3-亚甲基-2(3H)-呋喃酮)做为候选先导化合物进行深入的抗肿瘤药效学和机制研究。
首先，本文作者检测了不同浓度的S9对EGF诱导下的人横纹肌肉瘤Rh30细胞和人卵巢癌SK-OV-3细胞中PI3K-Akt-mTOR相关蛋白的磷酸化水平，发现S9能够有效对抗EGF引起的该信号通路激活，下调包括Akt、mTOR、S6kinase及转录因子eIF4E结合蛋白(4E binding protein，4E-BP1)的磷酸化水平，但是3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent proteinkinase1，PDK-1)磷酸化水平变化不明显，并在两株细胞中呈现相同的趋势。
激酶的磷酸化程度间接反应激酶的活性，但是并非激酶催化能力的直接体现。本文作者采用了细胞水平的激酶检测体系来评价S9作用下该信号通路主要激酶PI3K、PDK-1、Akt和mTOR催化能力的变化。本文作者用相应抗体从药物作用后的Rh30细胞免疫沉淀得到激酶，将其置于合适的反应体系中，通过对底物相应位点磷酸化水平的检测来获知激酶催化能力的变化。检测结果表明S9作用于细胞后，能够下调PI3K(10μM抑制率为54.7％)、Akt(10μM抑制率为69.5％)和mTOR(10μM抑制率为90.4％)的催化能力，使其无法有效磷酸化底物相应位点，但PDK-1所受影响甚少(10μM抑制率为24.5％)，这表明S9的确能够下调该信号通路相关激酶活性。
为了更直接的研究S9对于各个激酶是否有直接的抑制作用，本文作者选用了更加单一的分子水平激酶检测体系对上述激酶进行进一步研究。将活化的激酶从细胞中免疫沉淀下来，保持其活性，检测化合物、激酶、底物三者直接的相互关系，结果表明S9直接抑制PI3K(1μM抑制率为46.8％)、Akt(1μM抑制率为48.7％)和mTOR(1μM抑制率为58.7％)催化活性，而并非仅仅通过影响上游分子来抑制下游的激活，因此本文作者认为S9对于这条信号通路的抑制具有多层次的特性。另外通过ELISA检测31种受体、非受体及其他激酶的检测，本文作者发现S9对其它受试激酶没有或者仅有微弱的抑制作用。
PI3K受到激活后产生两个重要效应：一个是不依赖Akt的细胞膜褶皱，另一个是招募以Akt、PDK-1等为代表的含有PH(pleckstrin homology)结构域的蛋白膜移位。因此，我们采用IN Cell Analyzer1000和共聚焦显微镜来观察EGFP-Akt转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)在S9作用下的反应，发现S9作用以后细胞膜褶皱和Akt膜转位受到显著抑制，细胞内荧光颗粒的强度和数量都显著减少，10μMS9使荧光强度下降了67.7％，直接反应了PI3K的活性受到抑制且Akt激活过程受阻，这一结果同样在Rh30细胞株上得以验证。
雷帕霉素(rapamycin)既是研究信号通路的工具药，同时其同系物(rapalogues)也是前途光明的临床抗肿瘤候选药物。Rapalogues引起的一个广泛关注的细胞生物学效应是Akt丝氨酸473位点磷酸化的上调，这一点在大量体外培养肿瘤细胞和肿瘤病人组织中被发现，同时引起了一些关于rapalogues使用的质疑。在我们的实验中S9与rapamycin联用则能够完全逆转这一效应，这也为S9的临床前研究提供了线索。
PI3K-Akt-mTOR信号通路受到抑制后，因为蛋白合成受阻，产生的一个重要效应是细胞周期G0/G1期阻滞，然而在我们的研究中发现S9所引发的并非G0/G1期阻滞，而是G2/M期阻滞。免疫荧光实验观察到M期阻滞标志-cyclinB1核驻留，同时周期相关蛋白的变化也提示细胞处于M期阻滞。
M期阻滞是微管类药物引起的细胞生物学效应的共性。我们发现S9抑制纯化微管蛋白的组装(50μM抑制率为50％左右)，运用圆二色谱(circulardichroism，CD)法揭示S9能够引起微管蛋白α螺旋和β折叠的含量发生变化，即二级结构发生改变。表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SPR)实验显示S9与微管蛋白产生直接作用(结合常数为11.1μM)。通过S9与秋水仙素(colchicine)及长春碱类化合物的竞争实验明S9作用于微管的秋水仙素结合位点。
因此，上述实验显示S9能够同时作用于PI3K-Akt-mTOR信号通路和细胞的微管骨架。利用分子对接技术我们模拟了S9与上述分子的结合模式，进一步证明了我们在分子和细胞水平的一系列实验结果。
作为抗肿瘤药物的先导化合物，S9有着出色凋亡诱导和肿瘤生长抑制能力。利用AnnexinV-PI双染流式细胞术检测S9对于不同细胞株的凋亡诱导能力，结合Western印迹对各个细胞株Akt-mTOR激活程度的背景筛查，我们发现S9能够选择性高效诱导Akt-mTOR高度激活的肿瘤细胞凋亡，这为下步体内研究提供了适应症的相关线索。体外实验发现S9抑制多种来源的肿瘤细胞(包括单药耐药和多药耐药细胞株)增殖；对于Rh30和SMMC7721细胞的人癌裸小鼠移植瘤也有着较好的治疗作用，这些药效学结果揭示了S9作为先导化合物具有进一步修饰和优化的价值。
综上，本研究建立了PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂的快速筛选方法，并建立了细胞水平和分子水平的激酶活性检测模型。我们应用上述筛选方法对一系列化合物进行了筛选得到了一个新的PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂S9，并用IN Cell Analyzer高内涵筛选技术进行了确证。全新结构化合物S9能够同时抑制PI3K，Akt和mTOR三种激酶的活性，具有多靶点多层次的独特作用模式，在国际上尚无靶向该通路的triple-hits激酶抑制剂的报道；同时S9对其它受试激酶无显著影响，因此具有相对的选择特异性；特别有意义的是，S9同时具有紊乱细胞微管骨架的特性，SPR、CD等方法发现了其结合于微管秋水仙素结合位点。药效学研究发现S9显示了广泛的体内外肿瘤增殖抑制能力。作为同时具有靶点药物特点和细胞毒药物特点的化合物，S9可能临床上起到类似联合用药的效果。因此，作为一个新的结构，S9不仅具有独特的作用机制，同时也具有诱人的新药开发前景。