柚喀木虱体内韧皮部杆菌亚洲种的鉴定与分析

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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一。目前认为黄龙病是由原核生物薄壁菌门α-变型菌纲(Proteobacteriacea)的候选韧皮部杆菌属(℃andidatus Liberibacter spp.",简称“Ca L.spp.")所引起。田间柑橘黄龙病近距离传播主要通过木虱进行。已报道传播“Ca.L.spp.”的木虱有三种类型:柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama),非洲木虱(Trioza erytreae)和黑木虱(Diaphorinacommunis Mathur)。  2011年3月,在云南省瑞丽市勐秀乡邦孔村柠檬病果园发现另一种木虱,经鉴定为柚喀木虱(Cacopsylla citrisuga)。国内外对柚喀木虱的研究较少,而关于柚喀木虱与“Ca.L.spp.”可能引致柑橘不同品种病害关系等问题目前未见相关报道。本研究通过检测柚喀木虱体内携带“Ca.L.spp.”情况和获得的序列多态性,以确定柚喀木虱成为“Ca.L.spp.”传播媒介的可能性,以期为科学防控病害提供理论依据。主要取得以下结果:  1.对在云南省瑞丽市发现的柚喀木虱的形态特征、分布的地理条件等进行描述。  2.通过PCR技术从柚喀木虱中扩增得到了“Ca.L.asiaticus”的16S rDNA基因、omp基因、ITS间隔转录区基因,β-操纵子基因部分序列,利用限制性内切酶进行酶切、克隆测序分析及构建系统发育树,均证明柚喀木虱是“Ca.L。asiaticus”的新宿主。  3.通过PCR技术从云南柠檬样品DNA中扩增得到“Ca.L.asiaticus”的16SrDNA基因、omp基因、ITS间隔转录区基因和β-操纵子基因特异条带,首次从分子水平上证明云南瑞丽柠檬感染“Ca.L.asiaticus”;对PCR产物进行克隆测序分析,未见这些基因位点有变异。  4.检测柚喀木虱,云南柠檬,云南脐橙,广东沙糖橘和长春花体内携带噬菌体情况,发现柚喀木虱体内携带有噬菌体基因,并在所研究的基因中未发现有差异。  5.根据黄龙病菌全基因组序列,随机筛选16对基因并设计引物,用PCR检测了柚喀木虱、云南柠檬、云南脐橙、广东砂糖橘和长春花体内携带黄龙病菌菌株情况,对扩增获得的片段进行克隆和测序比对,发现从这些样品获得的序列与柑橘黄龙病菌“Ca.L.asiaticus”对应基因序列的相似性均达到98%以上。对所获得序列同NCBI数据库已公布的全基因组序列进行比对,引物对1750f/1750r、3495f/3495r和4555f/4555r扩增的核苷酸序列在不同样品之间存在碱基颠换、转换以及缺失情况。
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