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目的血管新生,作为一种由预先存在的血管而萌生新血管的生理或病理过程,在缺血性心脏病的恢复过程中扮演着重要的角色。其中血管内皮生长因子(VEGF)通过与之受体VEGFR2结合可以激活下游信号通路发挥促进血管新生的作用。信号传导及转录激活因子3(STAT3)是一类重要的转录因子,在血管新生中起着重要的调控作用,其在心脏中的缺失会严重阻碍缺血心脏的恢复。硫化氢作为一种气体信号分子,已被证明具有显著的促血管新生作用,特别是其在下肢缺血大鼠模型中作用的阐明,为硫化氢介导的促血管新生治疗提供了重要的理论依据。尽管如此,硫化氢作为气体分子,本身仍不能作为药物使用。所以基于此,我们课题组开发了内源性硫化氢的调节剂S-炔丙基半胱氨酸(SPRC),其可以通过直接作用于胱硫醚-γ-裂解酶(CTH)产生内源性硫化氢,从而使得硫化氢用于药物治疗成为可能。我们在前期实验中已发现SPRC对于缺血心脏具有显著的心脏保护作用,那么作为内源性硫化氢的调节剂,我们在本文主要研究了SPRC可能存在的促血管新生作用,以及在这一过程中重要转录因子STAT3可能介导的分子机制。方法我们首先使用人脐静脉内皮细胞,通过MTT实验、EdU掺入实验、细胞黏附实验、划痕损伤实验、transwell迁移实验以及Matrigel管腔形成实验评估了血管新生中的增殖、黏附、迁移及管腔形成四大指标,检测SPRC对体外血管新生的影响。通过大鼠动脉环模型、Matrigel栓模型、海绵植入模型、烫伤模型以及鸡胚绒毛尿囊膜模型检测了SPRC对体内正常状态下血管新生的影响。其中我们重点研究了Matrigel栓模型,通过HE染色、CD31免疫组化染色以及血红蛋白含量测定分析了血管密度及血流量。最后,我们建立了两个缺血模型,包括小鼠下肢缺血模型及大鼠心梗模型,检测了SPRC对体内缺血状态下血管新生的影响。在下肢缺血模型中,我们通过多普勒血流灌注成像分析了血流变化,通过血管造影分析了侧支循环的血管密度,通过CD31免疫组化染色分析了毛细血管的密度。在心梗模型中,我们通过心脏超声、TTC染色、Masson染色分析了心功能、梗死面积、纤维化面积等各项心脏指标,通过血管造影分析了侧支循环的血管密度。在机制研究中,我们首先通过Western检测了STAT3、MAPK家族以及Akt等蛋白在SPRC作用之后磷酸化水平的变化。我们使用STAT3 siRNA干扰内皮细胞中STAT3的表达再检测体外血管新生的各项指标,以证明STAT3在SPRC促血管新生中的关键作用。通过SPRC与STAT3共结晶检测两者是否存在直接的相互作用。通过免疫共沉淀检测VEGFR2/Grb2、VEGFR2/STAT3以及VEGFR2/JAK之间的相互作用。同时,我们使用VEGFR2磷酸化抑制剂SU5416或VEGFR2 siRNA作用内皮细胞,再分析STAT3磷酸化水平,以证明信号传导的方向。最后,我们分离胞核和胞浆蛋白Western检测或confocal直接定位,分析STAT3向核转移情况。通过EMSA分析核内STAT3活力,通过ChIP分析STAT3与特定基因启动子的结合情况,并且通过Western分析了基因转录后的蛋白表达情况。结果在体外实验中,SPRC可以促进人脐静脉内皮细胞的活力、增殖、黏附、迁移以及管腔形成。在正常状态下的体内实验中,SPRC可以促进大鼠动脉环中细胞的向外迁出,促进Matrigel栓中的血管生成,促进血管向植入海绵中的延伸,促进烫伤的愈合以及促进鸡胚绒毛尿囊膜上的血管新生。在缺血状态下的体内实验中,SPRC可以在小鼠下肢缺血模型中促进血流恢复、侧支循环生成以及毛细血管密度增加；在大鼠心梗模型中促进心功能恢复、梗死面积及纤维化面积减少以及侧支循环增加。SPRC可以显著促进STAT3磷酸化,内皮细胞敲除STAT3之后,SPRC促血管新生作用被抑制甚至消失,证明STAT3在介导这一过程中的关键作用。除此以外,SPRC亦促进Erk、JNK及Akt的磷酸化,但抑制p38磷酸化。共结晶的结果显示在加入SPRC前后,STAT3蛋白的半胱氨酸残基电子云密度没有额外的改变,排除了SPRC与STAT3直接作用的可能。免疫共沉淀显示SPRC给药后,STAT3与VEGFR2的作用加强,伴随着与Grb2的作用减少,暗示着STAT3向VEGFR2结合位点的聚集。而SU5416的加入或VEGFR2 siRNA的给予都会抑制SPRC诱导的STAT3磷酸化,证明信号由VEGFR2向STAT3传递。激活的STAT3可以看到向核内的转移,导致细胞核内STAT3活力的增高。ChiP的分析显示,SPRC引起STAT3与Vegf、Akt、Erk 及 Cth启动子的结合增强,而通过Western的确检测到了若干小时后VEGF及CTH蛋白合成的增加。结论我们通过本文的工作,证明了SPRC作为一个内源性硫化氢调节剂,可以有效地促进人脐静脉内皮细胞的增殖、黏附、迁移及管腔形成,同时在多种体内模型中验证了SPRC在正常状态及缺血状态下的促血管新生作用,对于硫化氢介导的促血管新生治疗具有重要的应用价值。同时,我们首次阐明了SPRC促血管新生中STAT3所介导的相关分子机制,包括H2S-VEGFR2-STAT3这条STAT3激活通路的首次提出,以及STAT3对于Vegf, Cth基因转录激活的发现,在硫化氢及STAT3的基础研究中具有极大的理论价值,同时也为联合用药的靶点寻找提供了线索。