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目前在植物基因工程中广泛应用启动子是组成型启动子,例如CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子。组成型启动子不能从时间和空间上有效的调控目的基因的表达。不加控制的、大量表达外源基因可能会对转基因植物造成毒害,也会在能源利用上造成浪费。所以对于诱导型、组织特异型的启动子的研究和利用就显的尤为重要。盐胁迫是影响植物产量的重要因素之一,目前关于盐诱导启动子的功能分析很少。
液泡型Na<+>/H<+>逆向运转体(NHXl)是近年来分离到的在植物耐盐性中起着重要作用的一类功能蛋白。液泡型Na<+>/H<+>逆向运转体蛋白体利用将液泡基质中质子顺电化学梯度运出液泡,同时将胞质中的Na<+>逆浓度梯度运入液泡内积累,这不仅能够降低胞质内的Na<+>以维持胞质正常的K<+>/Na<+>比值,还可以有效利用储存在液泡中的Na<+>作为渗透调节剂。
从棉花中克隆的液泡型Na<+>/H<+>逆向运转体基因GhNHX1,能够提高转基因烟草和水稻的耐盐性。以此为基础,本研究利用TAIL-PPCR方法克隆了GhNHX1的启动子,并通过PCR方法获得一系列5’端缺失片断,将启动子及5’端缺失片断与报告基因GUS融合,转化烟草悬浮细胞,利用0.1M NaCl处理转基因细胞,发现该启动子能响应盐胁迫的诱导。同时发现一段响应NaCl胁迫信号诱导较强的区域。主要研究结果如下:
1.根据GhNHX1基因5’非编码区设计特异引物,利用TAIL-PCR的方法,从棉花基因组中克隆了长度为1610bp的DNA片断。该DNA片断有49个碱基和GhNHX1基因5’非编码区重叠,认为包含GhNHX1的启动子。基因银行注册号EF650649。利用PlantCARE和PLACE两个启动子顺式元件分析网站分析启动子,发现位于转录起始位点上游-22/-16区存在一个TATA-box(ATATAAT),同时发现了盐诱导元件G3T1GMSCAM4元件(GAAAAA)和一些冷、干旱胁迫诱导有关的顺式作用元件,如MYB识别位点(AACG,WAACCA)、MYC识别位点(CANNTG)。预测的结果表明克隆到的该DNA片断具有典型启动子的一般特征,并且可能与各种胁迫诱导有关。
2.将GhNHX1启动子(-1561/+49)构建到植物双元表达载体pBI121载体,替换掉35S启动子,与报告基因GUS融合,通过农杆菌介导的转化方法转化烟草悬浮细胞。同时,利用PCR的方法对GhNHX1,启动子(-1561/+49)进行5’端缺失,将5’端缺失片断同样构建到pBI121载体,转化烟草悬浮细胞。将所有的转化体通过测定GUS活性来表示启动子的活性。GUS活性测定结果表明GhNHX1启动子是一个盐诱导的启动子,响应盐胁迫信号最强的是-52/+49区域,最强诱导比值达3.72,诱导后的表达量超过了35S的表达量。
3.GhNHXl启动子-52/-25区段连接在pBI121载体35S△46(35S启动子3’端46碱基,基本启动子),与报告基因GUS融合。GUS活性测定结果表明,该区段能够响应盐胁迫的诱导,诱导比值2.55。
4.将GhNHXl启动子-52/-25区段标记放射性同位素<32>P,与核蛋白结合,进行凝胶迁移滞留试验(EMSA),即进行聚丙稀酰胺凝胶电泳,电泳结束后放射自显影。结果表明,-52/-25区段能够和核蛋白特异结合,进一步说明该DNA区段可能具有转录调控的功能。
5.GhNHXl启动子-183/+49区段构建到pBI121载体,替换35S启动子,与报告基因GUS融合,转化烟草愈伤,培养成苗,然后进行GUS染色,分析GhNHX1启动子的组织表达模式。结果表明,该启动子在转基因烟草幼苗的所有组织都有表达,没有明显的组织特异性。