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第一部分Th17细胞在博莱霉素致系统性硬化病伴肺纤维化小鼠模型中的表达和意义目的研究Th17细胞及其相关因子在博莱霉素(BLM)致系统性硬化病(SSc)伴肺纤维化(PF, SSc-PF)小鼠模型中的表达,探讨它们是否参与SSc及SSc-PF的发病机制。方法将30只雌性BALB/c小鼠按随机数字表法分为2组：对照组10只,BLM皮下注射建立SSc模型组20只,根据PF (Ashcroft)半定量评分,<3级为SSc轻度PF组(SSc-A组)和≥3级SSc中重度PF组(SSc-B组)。HE和Masson′s染色观察小鼠背部注射部位皮肤和肺部病理改变,炎症和纤维化评分并测定羟脯氨酸(HYP)的含量。流式细胞计数检测小鼠外周血、皮肤和肺组织CD4~+IL-17~+(Th17)细胞的比例；实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测皮肤和肺组织维甲酸相关孤独受体gammat t(RORγt)、白细胞介素(IL)-17A、转化生长因子(TGF)-β1mRNA的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定外周血IL-17A、TGF-β1的含量,并分析这些指标与皮肤及肺部炎症及纤维化的相关性。结果(1)20只模型小鼠Ashcroft评分：0-2级有9只,为SSc-A组,≥3级有11只,为SSc-B组。皮肤、肺组织病理切片HE染色和Masson′s染色显示,对照组小鼠皮肤和肺组织结构完整,无明显炎症细胞浸润及胶原增生；模型组小鼠皮肤明显增厚,炎症细胞浸润,附属器萎缩,胶原明显增生,SSc-A组肺部结构无明显破坏,肺泡和支气管壁无或少量纤维性增厚,SSc-B组肺间质、肺泡和支气管壁中度以上纤维性增厚或纤维束形成,部分肺结构破坏,多量淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。皮肤炎症、肺部炎症和PF评分SSc-B组(2.82±0.75,2.36±0.81和4.0±1.41),SSc-A组(2.44±0.73,1.33±0.50和1.56±0.73)比对照组(0.40±0.52,0.40±0.52和0.60±0.70)明显增加(均P<0.05)；肺HYP含量SSc-B组(0.64±0.08)mg/g较SSc-A组(0.45±0.08)mg/g及对照组(0.38±0.16)mg/g明显增多；皮肤HYP含量SSc-B组(3.07±1.66) mg/g, SSc-A组(2.44±0.61)mg/g较对照组(1.45±0.40)mg/g明显增加,均P<0.05。(2)Th1 7细胞比例,外周血和皮肤SSc-B组[(1.61±0.49)%,(3.48±1.59)%],SSc-A组[(1.36±0.51)%,(2.89±1.55)%]较对照组[(0.85±0.23)%,(1.28±0.37)%]明显增加；肺组织SSc-B组(3.83±1.44)%较SSc-A组(2.30±0.98)%及对照组(1.32±0.37)%明显增高,均P<0.05。(3)皮肤SSc-B和SSc-A组IL-17A、RORγt和TGF-β1mRNA的表达量均较对照明显增高；肺组织SSc-B组IL-17A、RORγt、TGF-β1 mRNA的表达量的校正值分别为(2.79±2.16)、(30.54±32.97)和(0.24±0.23)较对照组(0.19±0.35)、(2.04±4.46)和(0.03±0.03)明显增加,SSc-B组IL-17AmRNA的表达量较SSc-A组增加,均P<0.05。(4)外周血IL-17A和TGF-β1的含量SSc-B组[(72.45±5:05)pg/ml, (1397.02±157.64) pg/ml], SSc-A组[(70.83±5.05)pg/ml,(1382.72±161.77)pg/m1]较对照组[(63.89±4.48)pg/ml,(1165.76±140.44)pg/ml]明显增高,均P<0.01。(5)外周血Th17细胞与皮肤及肺部炎症、皮肤及肺HYP含量、外周血IL-17A含量密切正相关(r值为0.499、0.604、0.387、0.374、0.560,均P<0.05)；肺组织Thl7细胞与肺部炎症、肺HYP含量、肺组织IL-17A mRNA的表达量密切正相关(r值为0.683、0.663、0.605,均P<0.01)；皮肤Th17细胞与皮肤炎症、皮肤HYP含量、皮肤IL-17AmRNA的表达量密切正相关(r值为0.632、0.544、0.406,均P<0.05)；外周血IL-17A的含量与皮肤及肺部炎症、皮肤及肺HYP含量、外周血TGF-β1含量密切正相关(r值为0.728、0.642、0.652、0.650、0.401,均P<0.05),肺组织IL-17AmRNA的表达量与肺组织TGF-β1mRNA的表达量(r值为0.801,P<0.001),皮肤IL-17AmRNA的表达量与皮肤TGF-β1mRNA的表达量(r值为0.620,P<0.001)密切正相关。结论Th17细胞和IL-17A在SSc小鼠模型外周血、皮肤及肺组织表达增高并伴活性增强,以SSc伴明显PF小鼠更为显著,与皮肤和肺部炎症和纤维化病变密切相关,Th17细胞可能通过分泌IL-17A与TGF-β1相互作用,共同参与SSc和SSc-PF炎症和纤维化病变。第二部分CCR6/CCL20对博莱霉素致系统性硬化病伴肺纤维化小鼠Th17细胞趋化作用的研究目的研究Th17细胞趋化因子受体及相应的配体CCR6/CCL20在SSc小鼠外周血、皮肤、肺组织的表达情况及相关细胞因子水平,探讨CCR6/CCL20对SSc小鼠Th17细胞的趋化作用。方法将30只雌性BALB/c小鼠按随机数字表法分为2组：对照组10只,模型组：SSc A组和SSc B组(同第一部分)。HE和Masson′s染色观察小鼠背部注射部位皮肤和肺部病理改变,炎症和纤维化评分及羟脯氨酸(HYP)含量的测定。流式细胞技术检测外周血、皮肤和肺组织CD4+CCR6+、CD4+CCR6+IL-17+细胞的百分比。RT-PCR检测皮肤、肺组织CCL20、IL-17A、TGFβ1、IL-6mRNA的表达水平,ELISA检测外周血CCL20、IL-17A、TGFβ1IL-6的含量,并分析这些指标的相互关系。结果(1)皮肤炎症、肺部炎症和PF评分SSc-B组(2.82±0.75,2.36±0.81和4.0±1.41),SSc-A组(2.44±0.73,1.33±0.50和1.56±0.73)比对照组(0.40±0.52,0.40±0.52和0.60±0.70)明显增加(均P<0.05)；肺HYP含量SSc-B组(0.64±0.08)mg/g较SSc-A组(0.45±0.08)mg/g及对照组(0.38±0.16)mg/g明显增多；皮肤HYP含量SSc-B组(3.07±1.66) mg/g,SSc-A组(2.44±0.61).mg/g较对照组(1.45±0.40)mg/g明显增加,均P<0.05。(2)与对照组比较,SSc-B组外周血、肺组织、皮肤CD4+CCR6+细胞比例增加；外周血、皮肤SSc-B组CD4+CCR6+IL-17A+细胞比例[(0.18±0.07)%,(0.36±0.16)%]和SSc-A组[(0.19±0.07)%,(0.33±0.17)%]较对照组[(0.11±0.03)%,(0.15±0.05)%]增加,SSc-B组肺组织CD4+CCR6+IL-17A+细胞比例(0.48±0.32)%较SSc-A(0.29±0.24)%和对照组(0.25±0.15)%增加(均P<0.05)；SSc-B组皮肤和肺组织CCL20mRNA的表达和外周血CCL20的含量明显增高(均P<0.05)。(3)外周血CD4+CCR6+IL-17A+细胞比例与皮肤和肺部炎症,肺HYP的含量,CCL20含量密切正相关(r值为0.409、0.435、0.414、0.494,均P<0.05)；肺组织和皮肤CD4+CCR6+IL-17A+细胞的比例分别与肺部和皮肤炎症、肺部和皮肤HYP含量,肺部和皮肤CCL20mRNA的表达量密切正相关(r值为0.376～0.738,均P<0.05)。(4)与对照组比较,SSc-B组和SSc-A肺组织、皮肤IL-17A、TGFβ1、IL-6mRNA的表达量和外周血的含量明显增加,均P<0.05。外周血、肺组织CD4+CCR6+IL-17A+细胞和CCL20的表达量与IL-17A、TGFβ1、IL-6表达量密切正相关(r值为0.400～0.781,均P<0.05)。皮肤CD4+CCR6+IL-17A+细胞与IL-17A、TGFβ1、IL-6mRNA的表达量正相关(r值为0.545,0.436、0.400,均P<0.05)。结论Th17细胞可通过CCR6/CCL20趋化作用聚集在SSc-PF小鼠的皮肤及肺部病变部位,这种趋化作用是Th17细胞表达增加的原因之一,随PF病变程度的加重而增强。第三部分系统性硬化病小鼠CD4+T细胞IL-21的表达及IL-21和TGF-β1对CD4+T细胞向Th17细胞分化的影响目的观察SSc小鼠外周血、皮肤、肺组织中CD4+IL-17+L-21+和CD4+IL-21R+胞的比例,研究IL-21和TGF-β1对CD4+T细胞向Th17细胞分化的影响,进一步明确SSc中Th17细胞增加的原因及作用机制。方法将30只雌性BALB/c小鼠按随机数字表法分为2组：对照组10只,模型组：SSc-A组和SSc-B组(同第一部分)。HE和Masson′s染色观察小鼠背部注射部位皮肤和肺部病理改变,炎症和纤维化评分及羟脯氨酸(HYP)含量的测定。流式细胞术检测小鼠外周血、皮肤和肺组织中CD4+IL-17+IL-21+细胞、CD4+IL-21R+细胞比例,ELISA检测外周血IL-21的含量。无菌取SSc小鼠脾脏,磁珠分选CD4+T细胞,分别用rIL-21(50μg/L,IL-21组),TGF-β1 (10μg/L, TGF-β1组),IL-21 (50μg/L)+TGF-β1(10μg/L) (IL-21 TGF-β1组)和空白对照组进行体外刺激培养,72小时后收集细胞,流式细胞术检测各组Th17细胞数,RT-PCR检测培养细胞RORγt、IL-17AmRNA的表达水平,ELISA检测培养上清液中IL-17A的水平。结果(1)皮肤炎症及HYP含量、肺部炎症和PF评分SSc-B组,SSc-A组比对照组明显增加(均P<0.05)；肺HYP含量SSc-B组较SSc-A组及对照组明显增多,同第一部分。(2)外周血、肺组织、皮肤CD4+IL-17+IL-21+细胞的百分比：SSc-B组为[(0.11±0.06)%,(0.13±0.05)%,(0.15±0.09)%],SSc-A组[(0.10±0.06)%, (0.06±0.03)%, (0.16±0.10)%]比对照组[(0.02±0.02)%,(0.02±0.02)%,(0.00±0.01)%]明显增加,SSc-B组肺组织较SSc-A组明显增加,均P<0.05。外周血、肺组织、皮肤CD4+IL-21R+的百分比：SSc-B组为[(0.89±0.42)%,(1.56±0.39)%,(2.17±1.02)%],SSc-A组[(0.84±0.24)%, (1.50±0.50),(2.17±0.98)%]比对照组[(0.51±0.18)%,(1.03±0.40)%,(1.13±0.52)%]明显增加,均P<0.05。外周血IL-21的含量SSc-B组[(136.68±40.61) pg/ml], SSc-A组[(125.42±47.88)pg/ml]和较对照组[(76.89±26.46)pg/ml]明显增加,均P<0.05。(3)外周血CD4+IL-17+IL-21+和CD4+IL-21R+细胞的比例与皮肤和肺组织炎症,PF评分、外周血IL-21含量密切正相关(r值为0.383～0.668,均P<0.05)。皮肤CD4+IL-17+IL-21+细胞的比例与皮肤HYP密切正相关(r值为0.523,P=0.003)。肺组织CD4+IL-17+IL-21+和CD4+IL-21R+细胞的比例与肺部炎症及HYP含量密切正相关(r值为0.444～0.767,均P<0.05)。外周血IL-21的含量与皮肤和肺组织炎症,肺HYP的含量,外周血CD4+IL-17+IL-2+细胞密切正相关(r值为0.395-0.514,均P<0.05)。(4)SSc小鼠脾脏CD4+T细胞培养结果：Th17细胞比例IL-21组(3.34±1.18)%、IL-21TGF-β1组(5.85+2.45)%较对照组(1.44±0.34)%明显增加,IL-21组和IL-21TGF-β1组IL-17A和RORγt mRNA的表达量,细胞培养上清液IL-17A的含量较对照组明显增加,均P<0.05。结论：SSc小鼠外周血、皮肤和肺组织中CD4+IL-17+IL-21+与CD4+IL-21R+的比例增高,Th17细胞可分泌IL-21,通过IL-21/IL-21R+作用于SSc小鼠皮肤和肺部炎症和纤维化病变；IL-21可诱导CD4+T细胞分化为Th17细胞,联合TGF-β1作用更强。第四部分体外IL-17A对成纤维细胞增殖及分泌功能的影响目的观察IL-17A、TGF-β1对成纤维细胞(FB)增殖及分泌的影响及它们之间的相互作用,进一步探讨Th17细胞在系统性硬化病(SSc)纤维化形成中的作用。方法选用SSc小鼠肺FB原代培养,通过倒置显微镜观察形态,波形蛋白免疫组化技术对其进行纯度鉴定。用MTT法观察不同浓度IL-17A、TGF-β124小时内对FB增殖活性的影响,寻找最适的浓度。FB与(1)IL-17 A；(2)TGF-β1;(3)IL-17A+TGF-β1;(4)DMEM培养液4组共培养。Brdu ELISA方法检测24h、48h、72h FB的增殖活性；RT-PCR和蛋白质印迹(Western blot)法检测FB分泌I型胶原mRNA表达和蛋白浓度；ELISA检测细胞培养上清液IL-6水平。RT-PCR和ELISA检测(1)和(4)组TGF-β1mRNA的表达和细胞培养上清液TGF-β1含量。结果(1)培养的肺组织块紧密贴壁,倒置显微镜下观察组织块为暗黑色遮光区域,4-10d天可见周围有单个细胞游出,以梭形为主,细胞逐渐密集,11-20d细胞可传代,波形蛋白免疫组化染色为阳性。(2)MTT法显示：24h内IL-17A、TGF-β1随浓度增加均有促进FB增殖的作用,IL-17A在25μg/L,TGF-β1在12.5μg/L时对FB增殖活性作用最大。(3)Brdu ELISA显示：与正常对照组比较,加入IL-17A、TGF-β1细胞因子后,24、48、72hFB增殖活性逐渐增强,组内因素时间效应的F值773.040,组间因素效应的F值140.739,均P<0.01,IL-17A联合TGF-β1作用最强。(4)与正常对照组比较,加入IL-17A、TGF-β1细胞因子后,24、48、72h FB分泌I型胶原mRNA表达和蛋白的浓度逐渐增多,呈时间依赖性,组内因素时间效应的F值分别为55.242,202.817,组间因素效应的F值80.062,149.710,均P<0.001,IL-17A联合TGF-β1组尤为明显。(5)与正常对照组比较,加入IL-17A、TGF-β1细胞因子后,24、48、72h细胞培养上清液IL-6水平明显增多,组内因素时间效应的F值69.145,组间因素效应的F值159.62,均P<0.01。(6)与对照组比较,加入IL-17A细胞因子后,24、48、72h FB TGF-β1mRNA表达量增加,组内因素时间效应的F值8.71,组间因素效应的F值65.880,均P<0.05。细胞培养上清液TGF-β1水平增加,组内因素时间效应的F值22.71,组间因素效应的F值170.496,均P<0.01。结论：IL-17A可促进FB增殖及分泌I型胶原和IL-6,呈时间依赖性,联合TGF-β1作用更强,IL-17A可增强FB分泌TGF-β1,它们在SSc纤维化病变中具有协同作用。