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研究背景: 丙型肝炎病毒(HCV)感染被认为是慢性肝炎的主要原因。慢性丙型肝炎患者首先发展为慢性炎症，导致肝硬化（20-40％），随后（4-6％的患者）发展成肝细胞癌（感染后的10-40年）。目前肝细胞癌的发病机制尚不明确，其与HCV相关性仍然存在争议，研究表明HCV蛋白可加强致癌转化。HCV-RNA基因编码多聚蛋白前体，可经病毒自身蛋白酶和宿主细胞作用后生成病毒体结构蛋白（核心蛋白和糖蛋白E1和E2）和非结构(NS)蛋白(p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。在体内HCV核心蛋白(HCV core)可通过各种信号途径来介导免疫反应，促使炎症的发生。 锌转运蛋白通过调节锌离子流入，流出和分布到细胞器中，来维持细胞内的锌稳态，包括免疫系统的稳态。锌转运蛋白包括两个蛋白家族:ZIPs(SLC39)和ZnTs(SLC30)。ZIPs转运蛋白使细胞质内锌离子含量升高，ZnTs转运蛋白使细胞质内锌离子含量降低，SLC39A8基因编码的ZIP8属于ZIPs蛋白家族。Begum等人研究发现在人类免疫刺激的单核细胞和分化的巨噬细胞中，ZIP8转运蛋白高水平表达。在ZIP8转染的细胞中，ZIP8主要定位于溶酶体上。研究显示，锌离子以ZIP8依赖的方式调节人体巨噬细胞中LPS介导的免疫反应，ZIP8敲除后会抑制在LPS驱动下的细胞内锌离子的积累，并使IL-10在mRNA水平上的表达升高。ZIP8通过调控Zn2+参与骨关节炎的发病机制。此外，ZIP8可通过NF-κB信号途径来负反馈调节促炎反应。 钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）属于蛋白磷酸酶2B家族，依赖于Ca2+/钙调素(CaM)调节，分布于许多哺乳动物器官。前期研究发现，在体外LPS刺激下CaN可以通过NF-κB信号途径来调节炎症因子的释放，如:IL-2，NO。在CaN催化结构域中，二价金属离子如:Zn2+和Fe2+为必要元素，并且在体外可被Mn2+和Ni2+激活。 研究目的: 检测正常人，丙肝患者和治愈后丙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中ZIP8 mRNA的表达情况，探讨慢性丙型肝炎与ZIP8的关系。通过ZIP8过表达、RNA干扰和缺锌、加锌处理HepG2细胞来探讨HepG2细胞对HCV core免疫应答过程中ZIP8的作用。 实验方法: 1.临床标本 收集正常人(n=28)，丙型肝炎患者(n=39)，治愈后丙型肝炎患者(n=49)血液标本，用qRT-PCR方法来检测ZIP8 mRNA的表达。 2.HCV core对HepG2细胞ZIP8表达的影响 培养HepG2细胞，脂质体转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-HCV core质粒，24h后收集细胞，用qRT-PCR和Western blot方法检测ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表达。 3.ZIP8在HCV core免疫应答过程中的作用 (1) ZIP8、HCV core表达载体共转染HepG2细胞，设为三组: Vector、HCVc和HCVc+ZIP8，转染24h后，收集细胞。 (2) ZIP8 RNA干扰转染HepG2细胞，48h后，转染HCV core表达质粒，分为三组: Vector+NCsi、， HCVc+NCsi和HCVc+ZIP8si，继续培养24h后，收集细胞。 4.ZIP8通过调控Zn2+在HCV core免疫应答过程中的作用 (1)用2.5μM TPEN、50μM ZnCl2预处理HepG2细胞1h，然后转染HCVcore表达载体，设为四组: Vector、 HCVc、HCVc+ ZrCl2和HCVc+TPEN，继续培养24h后，收集细胞 (2) ZIP8 RNA干扰转染HepG2细胞，48h后，用50μM ZnCl2预处理HepG2细胞1h，然后转染HCV core表达载体，设为四组:Vector+NCsi、HCVc+NCsi、 HCVc+ZIP8si和HCVc+ZIP8si+ZnCl2，继续培养24h后，收集细胞。 以上收集的细胞用于提取RNA，细胞内蛋白，胞内核蛋白，进一步用qRT-PCR检测NF-κBp65、 IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表达。用Western blot检测IKKβ、p-IKKβ以及核蛋白p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。 5.ZIP8和Zn2+对CaN活性的影响 提取各组细胞内蛋白，用CaN试剂盒检测各组CaN活性。 6.细胞内锌含量的测定 用锌离子荧光探针来检测HCVc、HCVc+ZIP8、HCVc+ZnCl2、 HCVc+TPEN、HCVc+ZIP8si和HCVc+ZIP8si+ ZnCl2这六组实验组中细胞内锌离子含量。 实验结果: 1.临床标本 与正常对照组相比，ZIP8 mRNA表达水平在丙型肝炎患者中显著降低;在治愈后丙肝患者中无明显差异。与丙肝患者相比，ZIP8 mRNA在治愈后的丙肝患者中表达显著升高。 2.HCV core上调HepG2细胞ZIP8的表达 与对照组相比，HCV core能够显著增加ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表达。 3.ZIP8在HCV core免疫应答过程中的作用 qRT-PCR结果显示:ZIP8过表达能够显著降低NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表达;ZIP8 RNA干扰能够显著升高NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表达。Western blot结果显示:ZIP8过表达能够显著降低IKKβ、p-IKKβ和核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。ZIP8RNA干扰能够显著升高IKKβ、p-IKKβ和核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。 4.ZIP8通过调控Zn2+在HCV core免疫应答过程中的作用 qRT-PCR结果显示:50μM ZnCl2加锌处理能够使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著降低;2.5μM TPEN缺锌处理能够使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著升高;当ZIP8被敲除后，50μMZnCl2加锌处理同样能够使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著降低。Western blot结果显示:50μM ZnCl2加锌处理能够显著降低IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达;2.5μM TPEN缺锌处理能够显著升高IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达;当ZIP8被敲除后，50μM ZnCl2加锌处理同样能够显著降低IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。 5.ZIP8和Zn2+对CaN活性的影响 ZIP8过表达能够显著抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高;ZIP8 RNA干扰能够显著诱导CaN活性的升高;50μM ZnCl2加锌处理能够显著抑制由HCVcore诱导的CaN活性的升高;2.5μM TPEN缺锌处理能够显著诱导CaN活性的升高;当ZIP8被敲除后，50μMZnCl2加锌处理同样能够显著抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高。由此可见，ZIP8可通过调控Zn2+来抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高。 6.细胞内锌含量的测定 HCVc+ZIP8和HCVc+ZnCl2对应于对照组HCVc荧光强度明显增强;HCVc+ZIP8si和HCVc+TPEN对应于对照组HCVc荧光强度明显减弱;HCVc+ZIP8si+ZnCl2对应于对照组HCVc+ZIP8si荧光强度明显增强。 结论: 1.临床标本结果显示:与正常对照组相比，ZIP8 mRNA表达水平在丙型肝炎患者中显著降低;在治愈后丙肝患者中无明显差异。推测ZIP8可能与HCV感染有一定的联系。 2.体外实验显示，ZIP8过表达和Zn2+可显著抑制由HCV core诱导的炎症因子表达的上调，NF-κB以及CaN活性的升高，而沉默表达ZIP8和缺锌处理则呈现出相反的结果。由此可见，ZIP8可通过调控Zn2+抑制炎症的发生，具体的机制有待进一步研究。