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花药发育过程涉及细胞分化、减数分裂等一系列复杂过程,其中绒毡层细胞对花药发育起重要作用。绒毡层细胞需要经历一个细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)的过程来为花粉外壁的形成以及花粉的成熟提供必需的营养物质。但是,人们对绒毡层细胞PCD过程以及这个过程是如何影响花粉外壁发育的调控机理知之甚少。我们已经知道在拟南芥花药发育过程中,存在一个绒毡层特异表达的基因AMS(ABORTED MICROSPORES),其编码bHLH类转录因子,且该基因的缺失后会导致花粉不能正常形成,最终导致雄性不育的发生。但AMS是如何参与花药发育调控的过程我们仍不是很清楚;因此,本研究以模式生物拟南芥为实验材料,以AMS基因为研究对象,采用形态学、分子生物学、遗传学和生物信息学等方法手段,在DNA、RNA和蛋白质等水平上,来系统的研究和分析AMS在花药发育的过程中的主要作用,以此阐述植物花药发育和花粉形成过程中的发生的可能分子机制。
本研究中,我们首先使用透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)、扫描电镜(Scanning Electron:Microscopy,SEM)以及荧光显微镜观察等方法,对ares突变体进行细致的形态学分析,结果表明AMS突变后,会导致绒毡层细胞发生异常膨大、正常的PCD过程受阻、不能正常形成花粉外壁、而最终导致花粉的完全败育(雄性不育的发生)。我们同时利用全基因组表达谱芯片分析,表明AgS基因突变后,会对花药发育过程中的至少549个基因(361个基因下调和188个基因上调)的表达情况产生影响;进一步对发生改变的549个基因进行KOG(Eukaryotic Orthologous Groups ofproteins)和GO(Gene Ontology)功能分类分析,可以获知AMS缺失后,的确会影响绒毡层细胞的PCD过程相关基因的转录水平发生改变,同时还对花粉发育过程中的脂类物质形成和代谢产生类基因的转录水平产生重要影响;因此,形态学观察和转录组分析都表明,AMS基因在拟南芥花药发育的过程中的生物学功能,可能主要包括:参与调控绒毡层细胞PCD过程,以及花粉外壁(脂类成分)的形成过程两个方面。
为了进一步寻找AMS可能直接调控的基因,我们还通过体外DNA结合实验(DNA binding site),证明在DNA水平上,AMS能特异性的与“CANNTG”(E-box)调控元件结合;并进一步通过全基因组转录组基因信息分析,查找ams突变体中发生下调基因启动子区域E-box的存在和分布情况,采用植物体内染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)方法,筛选处AMS可以直接调控13个花药中重要功能基因,这些基因主要参与脂类、寡肽及离子的运输,脂肪酸的合成及代谢等重要的花药发育的生物学过程。并通过突变体(T-DNA插入)遗传学实验和体外蛋白结合实验(E1ectrophoretic MobilityShift Assay,EMSA),证实了一个AMS的直接下游基因WBC27(属于ABC转运蛋白家族)可以直接被AMS在DNA水平上结合并调控,该基因的缺失同样会导致类似于ams的花粉败育和雄性不育的发生,从而证实体内ChIP实验的可行性和可信度。同时,在蛋白水平上,也通过酵母双杂(Yeast Two-Hybrid,Y-2H)和Pull Down体外蛋白结合实验,证明AMS能与其它转录因子(AtbHLH089和AtbHL,H091)及功能蛋白ATA20存在相互作用。
最后,为了进一步更加全面的了解AMS的生物学功能,我们还使用基因共表达(Co-expression)分析和调控网络(network)的构建等生物信息学工具,在全基因组水平上寻找AMS直接调控的基因,来进一步阐明AMS在绒毡层的PCD过程以及花粉外壁的形成的调控机制,结果同样表明,AMS可以在脂类肽链的合成(KCSs)、修饰(P450)、运输(LTP和ABC转运蛋白)以及小孢子外壁蛋白(EXL5)合成等各个方面,来精细完成对花粉外壁(脂类成分为主)发育的调控。
综合以上研究结果,本研究表明AMS是花药发育的一个关键承上启下调控因子,是绒毡层细胞的程序性死亡和花粉外壁发育所必需的,是绒毡层发育调控网络中的重要组成部分。本研究结果对于阐明植物花药发育和花粉形成的分子机制具有重要意义。