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雄性不育是植物中普遍存在的现象,并在作物杂交育种中被广泛利用。水稻是重要的粮食作物和单子叶模式植物,对其雄性生殖发育的分子机理进行研究,在理论上和应用上都具有十分重要的意义。近年来对水稻雄性生殖发育的研究取得了一定的进展,但各发育阶段的分子调控机制仍不清楚,有待进一步的探索。
本论文以水稻雄性不育突变体tapetumabnormaldegenerationl(tade1)为研究材料,通过基因克隆和基因功能研究来阐述TADE1基因在水稻雄性生殖发育过程中的作用,结果如下:
1.tade1突变体的花药瘦小、萎缩,不能产生花粉粒;授以野生型花粉,可以正常结实,表明tade1是雄性不育突变体。tade1/+杂合株的后代呈现3:1的孟德尔分离比,表明tade1是单基因控制的隐性突变体。
2.对tade1突变体各时期花药的树脂半薄切片观察和TUNEL分析发现,tade1突变体可以产生四分体小孢子,但由于绒毡层细胞的降解时间提前,致使小孢子从四分体中释放出来以后并不能进一步发育、而是逐渐崩解,最终药腔内充满小孢子崩解后的碎片。这一结果表明,TADE1基因影响绒毡层的降解和小孢子的后期发育过程。
3.利用图位克隆方法,我们获得了TADE1基因,并发现tade1突变体是由于水稻内源转座子Tosl7插入TADE1基因的第二个外显子中造成的。用构建的3种互补载体(P1-gDNA、P1-cDNA和P1-cDNA-GFP)分别转化tade1突变体的幼穗愈伤组织,获得的转基因植株可以恢复至野生表型,而转化空载体的对照植株的表型不能恢复;此外,TADE1-RNAi干扰载体转基因植株也呈现出类似tade1的突变表型。
4.基因表达模式分析表明,TADE1基因较特异地在花药绒毡层和四分体小孢子中表达,这与TADE1在水稻花药发育过程中所行使的功能是一致的。
5.TADE1基因编码一个含有bHLH结构域的DNA结合蛋白,在酵母中具有转录激活活性;但水稻原生质体瞬时表达实验的结果表明,TADE1-GFP融合蛋白的荧光信号在细胞核与细胞质中均有分布;因此,我们推测TADE1可能是一个转录因子。
6.在tade1突变体中,绒毡层程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)的正调控因子TDR和API5的表达上调,这和tade1突变体绒毡层提前降解的异常表型是一致的;此外,DPW和OsMS2的表达下调,表明它们位于TADE1基因的下游,可能受到TADE1直接或间接的调控。
我们的研究结果表明,TADE1基因是水稻花药发育过程中的重要调节因子,参与调控绒毡层降解的起始,进而影响减数分裂后小孢子的发育过程。