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本研究采用统计学方法对我国南海澳大利亚厚皮海绵共附生链霉菌DA11产几丁质酶的发酵培养进行了优化,并对其产生的几丁质酶进行了分离纯化及相关酶学性质的分析。
㈠在已有文献中培养基的基础上,首先通过单因素法,找到了适合DA11生长、产酶的碳氮源,分别是半乳糖和蛋白胨;第二步通过Plackett–Burman实验确定了对产酶影响最重要的三个因素是半乳糖,胶体几丁质和硫酸镁,第三步采用响应曲面法中的Box-Bohnken方法确定了最优发酵培养基的组成为5.00 g/L 半乳糖,2.62 g/L 胶体几丁质,0.10 g/L MgSO4·7H2O,12.5g/L蛋白胨,1.5g/L PO43-(KH2PO4 0.45g/L,K2HPO4 1.05g/L),12.5g/L 粉末几丁质,0.03 g/L FeSO4和0.03g/L ZnSO4·7H2O。通过优化,使放线菌DA11的最大产酶活力达到1559.2 U/g 细胞干重(36.43U/mL),最大细胞干重是 23.3 g/L,分别是原培养基的39.2倍和2.6倍。
㈡利用最优产酶培养基对菌种进行发酵,然后进行分离纯化。采用硫酸铵饱和沉淀、胶体几丁质亲和以及DEAE-cellulose离子交换柱层析进行纯化。通过纯化,得到了比活力为2.95 Umg-1的几丁质纯酶,利用SDS-PAGE得到一个分子量大约为34kDa的单一条带。几丁质纯酶有抑制黑曲霉和白假丝酵母生长的能力;它的最适酶反应温度、pH、盐度分别是50 ℃,8.0和45 g‰ psu,体现了海洋生物酶耐盐耐碱的特点;另外,Mn2+,Co2+,Cu2+,Zn2+和Mg2+都可提高几丁质酶活,而Ca2+,Fe2+和Ba2+能够抑制酶活。通过对几丁质酶动力学常数的考查,胶体几丁质较高的Vmax(0.82 mg product/min·mg protein)和较低的 Km(0.019 mg/mL),证实了胶体几丁质是较为适合的酶反应底物。