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G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCRs)是一类具有7次跨膜螺旋结构的膜蛋白受体,是哺乳动物中最大和最多样的细胞膜蛋白超家族之一,参与了细胞信号传递。GPCRs功能的失调会导致产生许多疾病,如抑郁症、精神分裂症、失眠、阿尔茨海默症、帕金森症、心脑血管疾病、炎症、色盲症和哮喘等。当今最畅销的上市药物中,20%属于GPCRs相关药物。因此,研究CPCRs的结构和功能关系,以及他们复杂信号途径和信号转导机制,将会给药物市场的开拓带来广阔的前景。CB2的是G-蛋白偶联受体的家庭成员之一。CB2受体表达于所有的免疫细胞,被发现在调节多种免疫细胞迁移、增值中起到不同的效用。因此,明确CB2的内吞及其介导的信号转导机制,了解CB2在免疫调节作用中的重要性,对抗炎症药物研究有举足轻重的意义。研究表明,表达于HEK293的CB2受体在配体WIN55,212-2刺激下迅速经clathrin发生内吞,并由arrestin3参与调节。研究通过蔗糖、网格蛋白抑制剂MβDC预处理或siRNA干扰网格蛋白的表达,CB2受体的内吞均受到显著抑制,说明其内吞是网格蛋白依赖性的,同时共表达发动蛋白(Dynamin)功能缺失型突变体K44A发现,Dynamin也参与内吞调控。受体内吞后主要和内涵体标记transferrin-Alexa Fluor594共定位,不与溶酶体标记lysotracker DND-99共定位。当配体移除后,CB2能部分回膜,蛋白酶抑制剂MG132预处理能抑制内吞,这说明CB2内吞后部分经内涵体转运回膜,而部分可能进入泛素途径降解。百日咳毒素PTX预处理能抑制WIN55,212-2对forskolin引起的胞内cAMP含量升高的抑制,抑制WIN55,212-2介导的ERK1/2下游信号,但不能抑制CB2内吞,说明Gi参与CB2活化后的下游信号,但不参与内吞。我们对CB2几个胞内环用CB1几个相应内环替换形成的嵌合体,以及ICL2几个定点突变体进行了相应的研究。发现CB2的ICL2嵌合体能双偶联Gi和Gs。进一步研究发现,CB2Pro-139突变成Leu能刺激cAMP的产生,能通过cAMP/PKA途径和Gi依赖途径激活ERK1/2,这说明位于高度保守的第2内环DRY(X)5PP结构域的Pro-139位点在CB2受体和G蛋白偶联的过程中起到关键作用。我们还将位于DRY(X)5PP结构域内的Leu135突变成Ala, lie, Val,发现Leu135位点及该位点氨基酸大小和侧链长短对受体的正确折叠、自激活及偶联G蛋白类型有很密切的关系。通过缺失突变和定点突变,我们发现CB2羧基端在受体磷酸化和内吞上扮演重要角色。CB2羧基端E341-C360缺失突变体Cter-1和位于V321-T340间的S335、S336、T338、T340进行同时丙氨酸突变的SSTT/A突变体的内吞受到显著的影响。Cter-1缺失突变体和SSTT/A突变体几乎不能与arrestin3结合,且Cter-1缺失突变体和SSTT/A突变体ERK1/2信号比野生型持久。说明位于CB2羧基末端远端的丝氨酸苏氨酸簇是CB2磷酸化的关键位点。通过上述研究,我们在HEK293细胞系中系统阐明CB2受体内吞的信号机制,发现了影响CB2偶联G蛋白类型的关键内环和氨基酸,以及氨基酸大小对受体折叠的影响,认为羧基端参与受体磷酸化、arrestin3结合和内吞的过程。我们希望通过后续实验,进一步阐明CB2从激活到产生ERK1/2信号的具体途径。