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背景中医理论认为,肾主生殖,与“肾精”密切相关。肾精不足,则生殖之精匮乏,导致不育不孕。“肾精”物质基础至今未明。课题组提出“促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）可能是肾精的重要生物物质基础”的假设,并初步验证了“肾精通于脑”、“肾精主骨”、“肾精化气强卫”等方面与EPO的相关性。本研究通过观察三种雄性动物模型（2种肾虚生殖功能低下,1种EPO基因敲除）体内的EPO变化,以及补充外源性EPO或给予补肾益精经典方药对三种雄性动物模型的改善作用及其机制,拟揭示EPO对肾虚雄性生殖功能的影响。从而从生殖的角度证明EPO可能是‘肾精’的重要物质基础,阐释“肾精藏生殖之精”的中医理论。本研究得到国家自然科学基金面上项目（81473549）,2018年中央高校基本科研业务费学生项目（XDJK2018D027）的支持。目的1.观察雄性EPO基因敲除小鼠、自然衰老小鼠、肾虚生殖低下大鼠体内EPO的变化,以及外源性rhEPO的逆转作用;2.观察“补肾益精”经典方右归饮对EPO基因敲除小鼠、雄性自然衰老小鼠、肾虚生殖低下大鼠的改善作用,并探讨其作用机制是否与HIF1α-STAT5通路相关;3.拟通过上述试验揭示EPO对肾虚雄性生殖功能的影响。从而从生殖的角度证明“EPO可能是‘肾精’的重要物质基础”,阐释“肾精藏生殖之精”的中医理论。方法与结果1.EPO与肾虚雄性动物生殖功能低下的相关性研究方法:（1）建立EPO基因全身条件性敲除小鼠:本研究设计并委托基因公司定制获得“目标基因锚定鼠EPO（flox/flox）小鼠”和“敲除工具鼠UBC-CreERT2小鼠”,将两种小鼠进行交配,取子鼠进行鉴定,筛选得到“EPO（flox/flox）-CreERT2小鼠”。再选取其中8周龄雄性EPO（flox/flox）-CreERT2子鼠（待EPO基因敲除小鼠）和雄性EPO（flox/flox）小鼠（野生型,WT）,均腹腔注射100 mg·kg-1他莫昔芬（执行EPO基因敲除的药物）连续5天,从第6天开始小鼠正常饲养28天,每7天测定小鼠体温、体重,至第34天处死小鼠,取材检测各项指标。其中EPO（flox/flox）-CreERT2小鼠注射他莫昔芬后即成为“EPO基因条件性全身敲除（EPO-KO）小鼠”,检测该小鼠肾脏、睾丸中EPO蛋白表达,计算EPO基因在以上组织的敲除率,判断敲除成功后,用于后续各项试验。（2）复制自然衰老致肾虚雄性生殖功能低下小鼠模型,小鼠正常饲养12个月造模,模型成功判断标准:（1）与青年小鼠相比,每只衰老模型小鼠自主活动、新物体识别、转棒时间显著降低,血清中SOD、T-AOC降低,MDA升高即为衰老模型成功;（2）与青年小鼠均值相比,造模后每只小鼠血清中UREA、CREA升高,ACTH、T、T3或T4降低,即为肾虚模型成功。（3）与青年对照组小鼠均值相比,造模后每只小鼠血清中T、E2、LDH、DHT降低,精子数量减少、精子畸形率升高,即为生殖功能损害模型成功。（4）同时满足上述（1）（2）（3）三个判断标准即为自然衰老小鼠肾虚雄性生殖功能低下模型成功。取自然衰老肾虚雄性生殖功能损害模型成功的小鼠用于后续试验。（3）复制腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠模型。雄性SD大鼠随机分为正常组与造模组,造模组用腺嘌呤150 mg·kg-1连续灌胃14天。模型成功判断标准:（1）与正常组大鼠均值相比,造模后每只大鼠血清中UREA、CREA含量升高,ACTH、T、T3或T4含量降低,即为肾虚模型成功。（2）与正常组大鼠均值相比,造模后每只大鼠血清中T、E2、LDH、DHT、FSH降低,精子畸形率升高、数量降低;性行为:骑跨次数、插入次数、射精次数降低,即为生殖功能损害模型成功。（3）同时满足上述（1）（2）两个判断标准即为肾虚雄性生殖功能损害模型成功。取肾虚雄性生殖功能损害模型成功的大鼠用于后续试验。对比检查以上3个动物模型的外观形态,血常规,血清生化指标,脏器病理学,精子数量、畸形率,肾脏、睾丸HIF1α-STAT5通路关键蛋白含量。结果:（1）EPO基因条件性全身敲除小鼠成功建立,具有肾精亏虚证及雄性生殖功能低下的临床表现。EPO基因在EPO基因敲除小鼠肾脏和睾丸中的敲除率分别为77.53%、76.86%。与野生型小鼠相比,EPO基因敲除小鼠毛色变差,出现腹水,体重、体温、摄食量显著减少;肝、脾、肺、肾、脑垂体、睾丸、附睾、前列腺、精囊、脊柱组织形态显著改变;精子数量显著下降、畸形率显著上升,精子外观、内部形态显著病变;血清EPO显著降低,SEPOR显著升高,EPO/SEPOR的比值显著降低;血常规指标Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT、PCT显著降低、HGB、LY、LY%、MCH、WBC显著升高;肾功能指标UREA、CREA显著升高;甲状腺指标ACTH、CORT、T3、T4的显著降低;氧化应激指标MDA显著升高,SOD、GSH-Px、T-AOC、LPO显著降低;免疫指标C3、C4、IL-2、IL-6、IGA、IGG、IGM显著降低;生殖指标T、E2、LH、DHT、FSH显著降低;肾脏、睾丸中HIF1α-STAT5通路蛋白显著下降（均p<0.05）。（2）自然衰老致肾虚雄性生殖功能低下小鼠EPO及其信号通路蛋白显著降低。与青年小鼠相比,衰老模型小鼠,外观形态、毛色较差,体重和体温降低;肾小球空泡、炎性因子较多;睾丸小体形态不完整,曲精管萎缩、充血;精子数量显著下降、畸形率显著上升;血常规RBC、HCT、HGB、MID、MID%、MCH、PCT显著降低;血清UREA、CREA显著升高;ACTH、CORT、T3、T4显著降低;MDA、LPO显著升高,SOD、GSH-PX、T-AOC显著降低;T、E2、LH、DHT、FSH显著降低;自主活动次数、转棒时间显著降低、新物体识别指数显著升高;血清EPO显著降低,SEPOR显著升高,EPO/SEPOR比值显著降低;肾脏与睾丸HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量显著降低（均p<0.05）。（3）腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠EPO显著下降,HIF1α-STAT5通路蛋白显著异常。与正常组相比,模型组大鼠外观形态、毛色较差,体重、体温降低;肾外观变白,肾小球囊腔较大,肾小管内腺嘌呤结晶、坏死、炎性细胞浸润较多;睾丸小体管腔内蓝染的钙盐沉积,曲精管萎缩、管腔疏松,充血;精子外观、内部病变;精子数量显著降低,精子畸形率显著上升;血常规Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT、PCT、MCH显著下降,LY、LY%、WBC显著上升;血清UREA、CREA显著上升;ACTH、CORT、T3、T4的含量显著降低;T、E2、LH、DHT、FSH均显著降低;骑跨次数、插入次数、射精次数均显著降低;血清EPO显著降低,SEPOR显著升高,EPO/SEPOR比值显著降低;肾脏和睾丸HIF-1α、EPO蛋白表达含量显著降低,p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量显著升高（均p<0.05）。2.外源性rhEPO对肾虚雄性生殖功能低下动物体质及EPO信号通路逆转作用观察方法:（1）外源性rhEPO对EPO基因敲除雄性小鼠的逆转试验:取8周龄雄性EPO基因敲除小鼠及其野生型小鼠,分为4组:EPO-KO组、WT组、EPO-KO+rhEPO 500 IU·kg-1、WT+rhEPO 500 IU·kg-1,每组5只。rhEPO组每三日皮下注射rhEPO,EPO-KO组、WT组给予等体积生理盐水,连续28天。检测动物外观、体重、体温,测定行为学、血常规、血清生化指标,脏器病理学,精子形态、数量、畸形率,肾脏、睾丸HIF1α-STAT5通路关键蛋白含量。（2）外源性rhEPO对自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠的逆转试验:自然衰老模型小鼠分为4组:衰老模型组、rhEPO 250 IU·kg-1、500 IU·kg-1、1000 IU·kg-1、每组15只,2月龄雄性小鼠15只为青年对照组。rhEPO组每三日皮下注射相应剂量rhEPO,衰老模型组给予等体积生理盐水,持续28天。检测动物外观、体重、体温,测定行为学、血常规、血清生化指标,肾脏、睾丸病理学,精子数量、畸形率,肾脏、睾丸HIF1α-STAT5通路关键蛋白含量。（3）外源性rhEPO对腺嘌呤致肾虚雄性生殖功低下大鼠的逆转试验:将造模成功大鼠随机分为4组:模型组、rhEPO 500 IU·kg-1、1000IU·kg-1、1500 IU·kg-1每组15只,正常组15只大鼠。第15天开始,除正常组外,隔日150 mg·kg-1腺嘌呤灌胃维持模型,rhEPO每三天皮下注射一次,模型组给予等体积生理盐水,持续30天。检测大鼠外观、体重、体温,测定性行为学、血常规、血清生化指标,肾脏、睾丸病理学,精子形态、数量、畸形率,肾脏、睾丸HIF1α-STAT5通路关键蛋白含量。（4）外源性rhEPO对3种TM4细胞损伤模型的保护作用及其机制研究:TM4细胞为模型,分别进行三种干预:采用Crispr Cas9技术敲除EPO基因;JAK2及STAT5蛋白抑制剂分别处理细胞,缺氧缺糖损伤。细胞干预后观察给予外源性rhEPO 12.5 U·mL-1后细胞增殖情况、LDH泄漏率、线粒体膜电位及对HIF1α-STAT5通路的影响。结果:（1）外源性rhEPO显著改善肾虚雄性生殖功能低下动物的体质及生殖功能。（1）外源性rhEPO显著改善EPO基因敲除雄性小鼠体质及生殖功能。与EPO基因敲除组相比,外源性rhEPO 500 IU·kg-1组外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾小球饱满,空泡较少,炎性因子较少;睾丸小体形态较完整,曲精管萎缩、充血较轻;精子数量显著上升、畸形率显著下降;血常规Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT显著升高、HGB、LY、MCH、WBC显著降低;血清UREA、CREA显著降低;ACTH、CORT、T3、T4显著升高;MDA显著降低,SOD、GSH-PX、T-AOC、LPO显著升高;T、E2、LH、DHT、FSH均显著升高;自主活动次数、转棒时间显著上升、新物体识别指数显著降低（均p<0.05）。（2）外源性rhEPO显著改善自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠体质及生殖功能。与衰老模型组相比,rhEPO 250、500、1000 IU·kg-1组小鼠,外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾小球饱满,空泡较少,炎性因子较少;睾丸小体形态较完整,曲精管萎缩、充血较轻;精子数量显著上升、畸形率显著下降;血常规RBC、HCT、HGB、MID、MID%、MCH、PCT显著升高;血清UREA、CREA显著降低;ACTH、CORT、T3、T4显著升高;MDA、LPO显著降低,SOD、GSH-PX、T-AOC显著升高;T、E2、LH、DHT、FSH显著升高;小鼠自主活动次数、转棒时间显著上升、新物体识别指数显著降低（均p<0.05）。（3）外源性rhEPO显著改善腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠体质及生殖功能。与模型组相比,rhEPO 500、1000、1500 IU·kg-1组大鼠,外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾外观形态显著改善,肾小球囊腔变小,肾小管内腺嘌呤结晶变少,凝固性坏死减少,炎性细胞浸润减少;睾丸小体形态趋于正常,管腔内钙盐沉积减少,曲精管缩、管腔疏松,血管壁增厚,充血的情况减轻;精子形态及组织结构病变显著缓解;精子数量显著上升、畸形率显著下降;血常规Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT、PCT、MCH显著上升,LY、LY%、WBC显著降低;血清UREA、CREA显著降低;ACTH、CORT、T3、T4的含量显著升高;T、E2、LH、DHT、FSH均显著升高;骑跨次数、插入次数、射精次数均显著升高（均p<0.05）;（2）外源性rhEPO显著调节肾虚雄性生殖低下动物EPO信号通路。（1）外源性rhEPO显著升高EPO基因敲除雄性小鼠EPO含量及其信号通路蛋白的表达。与EPO基因敲除小鼠相比,rhEPO 500 IU·kg-1组小鼠EPO显著上升,SEPOR显著下降,EPO/SEPOR的比值显著上升,肾脏与睾丸中EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均P<0.01）。（2）外源性rhEPO显著升高自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠EPO含量及其信号通路蛋白的表达。与自然衰老组小鼠相比,rhEPO 250、500、1000 IU·kg-1组小鼠,血清EPO显著上升,SEPOR显著下降,EPO/SEPOR的比值显著上升;肾脏与睾丸中HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均P<0.01）。（3）外源性rhEPO显著调节腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠EPO及其信号通路蛋白的表达。与模型组相比,rhEPO 250 IU·kg-1、500 IU·kg-1组血清EPO显著上升,rhEPO1500 IU·kg-1组EPO显著下降,rhEPO各组SEPOR显著下降、EPO/SEPOR的比值显著上升;肾脏与睾丸HIF-1α、EPO蛋白表达量增加,p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量下降（均p<0.05）。（3）外源性rhEPO对EPO基因敲除或缺氧缺糖损伤的TM4细胞具有显著的保护作用,对EPO下游通路抑制的TM4细胞无改善作用。（1）外源性rhEPO对EPO基因敲除损伤的TM4细胞有显著保护作用。与模型组相比,rhEPO 12.5 IU·mL-1显著促进TM4细胞增殖;显著抑制LDH泄漏率和线粒体膜电位的改变;使EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均p<0.05）。（2）外源性rhEPO对JAK2、STAT5蛋白抑制的TM4细胞无显著保护作用。与模型组相比,rhEPO 12.5 IU·mL-1对TM4细胞增殖、LDH泄漏率、线粒体膜电位及HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量均无显著改变。（3）外源性rhEPO对缺氧缺糖损伤的TM4细胞有显著保护作用。与模型组相比,rhEPO 12.5 IU·mL-1显著促进TM4细胞增殖;显著抑制LDH泄漏率和线粒体膜电位的改变;使HIF1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均p<0.05）。提示EPO及其信号通路对雄性生殖功能细胞具有重要调节作用。3.右归饮对肾虚雄性生殖低下动物的改善及对EPO信号通路的调节作用观察方法:（1）右归饮对EPO基因敲除雄性小鼠的试验:取8周龄雄性EPO基因敲除小鼠及其野生型小鼠,分为4组:EPO-KO组、WT组、EPO-KO+右归饮20 g·kg-1、WT+右归饮20 g·kg-1每组5只。右归饮组每日灌胃相应剂量右归饮,EPO-KO组、WT组每日给予等体积生理盐水,持续28天。检测方法和指标同“方法2（1）”。（2）右归饮对自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠的试验:造模成功的自然衰老雄性生殖功能低下模型小鼠分为4组:模型组、右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1组,每组15只,以2月龄雄性C57BL/6J小鼠15只为青年对照组。检测方法及指标同“方法2（2）”。（3）右归饮对腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠的试验:腺嘌呤造模成功的肾虚雄性生殖功能低下大鼠随机分为5组:模型组、右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1组、阳性药对照组(龟鹿二仙膏10 g·kg-1组),以正常大鼠15只为正常组。第15天开始,除正常组外,各组隔日给予150 mg·kg-1腺嘌呤灌胃维持模型,右归饮与龟鹿二仙膏组灌胃给药每日1次至第46天。检测方法及指标同“方法2（3）”。（4）右归饮对3种TM4细胞模型的保护作用及其机制研究:干预方式同“方法2（4）”。细胞干预后,考察给予右归饮100 ug·mL-1后细胞增殖情况、LDH泄漏率、线粒体膜电位及HIF1α-STAT5通路的影响。结果:（1）右归饮显著改善肾虚雄性生殖低下动物的体质及生殖能力。（1）右归饮对EPO基因敲除雄性小鼠体质及生殖能力无显著改善作用。与EPO基因敲除组相比,右归饮20 g·kg-1组小鼠外观形态、毛色、体温无改善;肾脏、睾丸病理形态无改善;精子数量、精子畸形率无改善;血常规MCH、LY、RBC、HCT、PCT、Gran、Gran%、Mid、Mid%无显著改变,WBC、HGB、LY%显著降低（均p<0.05）,血清UREA、CREA、ACTH、CORT、T3、T4、MDA、LPO、SOD、GSH-PX、T-AOC、T、E2、DHT、FSH均无显著改变,LH显著升高（p<0.05）;自主活动次数、转棒时间无显著改变,新物体识别指数显著下降（p<0.05）。（2）右归饮显著改善自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠体质及生殖能力。与衰老模型组相比,右归饮10、20、40 g·kg-1组小鼠,外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾小球饱满,空泡较少,炎性因子较少;睾丸小体形态较完整,曲精管萎缩、充血较轻;精子数量显著上升,精子畸形率显著下降;血常规RBC、HCT、HGB、MID、MID%、MCH、PCT显著降低;血清UREA、CREA显著降低;ACTH、CORT、T3、T4显著升高;MDA、LPO显著降低,SOD、GSH-PX、T-AOC显著升高;T、E2、LH、DHT、FSH均显著升高;小鼠自主活动次数、转棒时间显著上升、新物体识别指数显著降低（均p<0.05）。（3）右归饮显著改善腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠体质及生殖能力。与模型组相比,右归饮10、20、40 g·kg-1组大鼠外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾外观形态显著改善,肾小球囊腔变小,肾小管内腺嘌呤结晶变少,坏死减少,炎性细胞浸润减少;睾丸小体形态趋于正常,管腔内蓝染的钙盐沉积减少,曲精管萎缩减轻、管腔疏松,血管壁增厚,充血的情况减轻;精子形态及组织结构病变显著缓解;精子数量显著上升,精子畸形率显著下降;血常规Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT、PCT、MCH显著上升,LY、WBC显著降低;血清UREA、CREA显著降低;ACTH、CORT、T3、T4的含量显著升高;T、E2、LH、DHT、FSH均显著升高;骑跨次数、插入次数、射精次数均显著升高（均p<0.05）。（2）右归饮显著调节肾虚雄性生殖低下动物EPO及其信号通路。（1）右归饮对EPO基因敲除雄性小鼠EPO含量及其信号通路蛋白表达无显著调节作用。与EPO基因敲除小鼠相比,右归饮20 g·kg-1组小鼠血清EPO、SEPOR无显著改变;肾脏与睾丸中HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量无显著改变;（2）右归饮显著升高自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠EPO及其信号通路蛋白的表达。与自然衰老组小鼠相比,右归饮10、20、40 g·kg-1组小鼠血清EPO显著上升,SEPOR显著下降,EPO/SEPOR的比值显著上升,肾脏与睾丸HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均p<0.01）;（3）右归饮显著升高腺嘌呤致肾虚生殖雄性功能低下大鼠EPO及其信号通路蛋白的表达。与模型组相比,右归饮10、20、40 g·kg-1组小鼠血清EPO显著上升、SEPOR显著下降,EPO/SEPOR的比值显著上升;肾脏与睾丸HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量下降（均P<0.05）。（3）右归饮对缺氧缺糖损伤的TM4细胞有显著保护作用,对EPO基因敲除或EPO下游信号通路阻断的TM4细胞无改善的作用。（1）右归饮对EPO基因敲除的TM4细胞无显著改善。与模型组相比,右归饮100 ug·mL-1对TM4细胞的增殖、LDH泄漏率、线粒体膜电位及HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量无显著改变。（2）右归饮对JAK2、STAT5蛋白抑制的TM4无显著改善作用。与模型组相比,右归饮100 ug·mL-1对TM4细胞的增殖、线粒体膜电位及HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量均无显著改变。（3）右归饮对缺氧缺糖的TM4细胞有显著保护作用。与模型组相比,右归饮100 ug·mL-1显著促进TM4细胞增殖;显著抑制模型细胞损伤导致的LDH泄漏率和线粒体膜电位的改变;使HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均p<0.05）。提示右归饮对雄性生殖细胞的保护作用依赖于EPO及其信号通路。结论1.体内EPO的丢失或降低,与EPO基因敲除模型、自然衰老模型、腺嘌呤模型3种试验动物的肾虚体质及其雄性生殖功能低下密切相关;2.补充外源性rhEPO对EPO基因敲除模型、自然衰老模型、腺嘌呤模型3种试验动物的肾虚体质及其雄性生殖功能低下具有显著的逆转作用;3.补肾益精经典方右归饮对自然衰老模型、腺嘌呤模型2种肾虚雄性生殖功能低下动物的体质及其生殖功能具有显著的改善作用,其作用与升高EPO及其下游信号通路HIF-1α-STAT5的蛋白表达密切相关,对EPO基因敲除雄性小鼠模型无显著改善作用;4.外源性rhEPO和右归饮对EPO基因敲除、JAK2及STAT5蛋白抑制、缺氧缺糖损伤3种TM4细胞模型的干预试验结果显示,EPO及其下游信号通路是保护细胞损伤的关键环节,也是右归饮发挥作用的关键环节。5.本文建立了EPO基因条件性全身敲除小鼠模型,证明了EPO基因缺失雄性动物表型与“肾精亏虚证”患者临床表现的相似性,支持“EPO可能是肾精的重要生物物质基础”的假设。6.本文报道了EPO对肾虚动物雄性生殖功能的影响,从生殖的角度验证了“EPO可能是‘肾精’的重要物质基础”的假设,阐释了“肾精藏生殖之精”的中医理论。