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本文研究了碳源对棒状链霉菌克拉维酸(CA)发酵过程的影响,同时建立了基于复合培养基的棒状链霉菌蛋白质样品制备和二维电泳方法,对于基于不同发酵时间的蛋白谱进行了初步分析。
棒状链霉菌模式菌不能在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上生长,在甘油上生长良好;而工业生产菌株在以葡萄糖或甘油为唯一碳源的合成培养基上都能很好地生长。通过发酵过程补加精氨酸或甘油试验,发现C3是CA合成的限制性前体。分别以甘油、糊精、葡萄糖或(甘油+糊精)为主要碳源进行CA发酵时,对棒状链霉菌生长而言,在糊精中最好,在葡萄糖中最差,在甘油及混合碳源中适中;对CA合成而言,甘油最好,混合碳源次之,在糊精和葡萄糖中较差。另外,棒状链霉菌基质利用和中心代谢相关酶活的变化受碳源种类影响较大。
建立了适用于在复合培养基上培养的棒状链霉菌细胞样品蛋白质提取及二维电泳方法。采用液氮研磨方法破碎细胞,用TCA/丙酮沉淀法除盐,用含有7 mol/L尿素,2mol/L硫脲,2%CHAPS,20 mmol/L DTT,0.5%IPG缓冲液(pH3~10)的溶胀液重悬蛋白,应用pH梯度为4~7,长度为24 cm的固定化胶条进行第一向等电聚焦,浓度为12.5%的聚丙烯酰胺凝胶进行第二向SDS-PAGE,上样量为600μg,考马斯亮兰染色。对基于复合培养基的CA发酵过程对数生长期(24 h)和CA合成期(72 h)蛋白谱进行初步比较:培养24 h样品的胶上有1047个蛋白质点,72 h有1318个蛋白质点,两样品2-DE胶蛋白点的匹配率仅为66.13%。