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目的：
胃癌是一种常见的恶性肿瘤，其死亡率在世界范围内高居第二，在我国更居于第一位。但是，胃癌发生发展的分子机制目前尚不完全清楚，对其更深入的研究将有助于胃癌诊断、治疗和预防的提高。
p21激活激酶(p-21 activated kinase，PAKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase) Cdc42/Rac1、生长因子信号的下游主要靶蛋白，参与细胞内多个信号转导通路，发挥调节细胞运动、细胞周期演进、基因转录、细胞转化及介导生存与死亡信号等多种效应，并在肿瘤的发生发展过程中起到重要作用。迄今为止PAK家族共发现6个成员，根据其结构相似性，将它们分为两类，Ⅰ类包括PAK1-3，Ⅱ类包括PAK4-6。PAK4是目前研究得最深入的Ⅱ类成员，它在组织发育过程中及成熟组织中广泛表达，在细胞的生长、生存、增殖及迁移侵袭中起作用，并且与肿瘤的发生发展有密切关系。
转化生长因子-β(TGF-β)超家族是一类作用繁多的细胞因子，参与细胞增殖、分化、细胞外基质改建及胚胎发育等多种细胞活动，并在多种疾病尤其是肿瘤、纤维变性类疾病及自身免疫性疾病的发病中扮演着重要角色。Smads蛋白家族是TGF-β通路的重要下游蛋白，在将TGF-β信号从细胞表面膜受体传导到细胞核的过程中起关键作用，最终进入细胞核激活或者抑制下游靶基因的转录。Smads蛋白家族包括八个成员，分为R-Smads，Co-Smad和I-Smads三类。其信号传导过程具有选择性及特异性，Smad2/3是TGF-β1的下游R-Smads，在刺激后与膜受体形成短暂的复合体并被激活，之后与Co-Smad即Smad4结合形成复合体入核调控基因转录。
本研究以蛋白质相互作用为前提，在证实PAK4与Smad2/3/4在体内外的相互作用的基础上，探讨PAK4与TGF-β1/Smads通路之间的对话，及它们对胃癌细胞生长的作用，为明确胃癌发生发展的分子机制提供依据。
方法：
一、PAK4与Smad2/3/4在体内外相互作用的验证
1、用GST-pull down实验鉴定PAK4与Smad2/3/4在体外的相互作用并确定其作用的具体结构域。
2、免疫共沉淀实验确定PAK4与Smad2/3/4在细胞内的相互作用。
3、共焦激光扫描显微镜观察PAK4与Smad2/3/4的定位及共定位。
二、PAK4抑制受体介导的Smad2/3 C末端磷酸化通路
1、Western Blot检测PAK4对Smad2/3 C末端磷酸化的影响。
2、共焦激光扫描显微镜观察C末端磷酸化Smad2/3的核转位情况。
3、免疫共沉淀实验确定PAK4与Smad2/3/4、Smad4与Smad2/3间的相互作用情况。
4、Dual-Luciferase Assay System分析PAK4在不同细胞系中对Smad2/3反应原件活性的调控。
5、RT-PCR及Real time-PCR方法检测PAK4对TGF-β1下游靶基因PAI1mRNA表达的影响。
6、Western Blot检测PAK4对TGF-β1下游细胞周期相关蛋白表达的影响。
7、体外激酶分析实验检测PAK4对Smad2/3/4的磷酸化情况。
结果：
一、PAK4与Smad2/3/4在体内外相互作用的验证
1、PAK4与Smad2/3/4能够在体外直接结合，其作用的具体结构域为PAK4的1-40aa结合Smad3的1-132aa和402-425aa，PAK4的1-40aa结合Smad2的453-467aa，PAK4的1-201aa结合Smad4的1-138aa。
2、PAK4与Smad2/3/4能够在HEK293细胞及胃癌细胞SGC-7901内相互作用。
3、在HEK293细胞中，PAK4与Smad2/3/4共定位于细胞质。
二、PAK4抑制受体介导的Smad2/3 C末端磷酸化通路
1、在HEK293细胞中，过表达PAK4抑制TGF-β1刺激后受体介导的Smad2/3C末端磷酸化，沉默PAK4促进Smad2/3 C末端磷酸化。
2、在HEK293细胞中，Smad2/3 C末端磷酸化被PAK4抑制不依赖于PAK4的激酶活性。
3、在HEK293细胞中，PAK4通过与Smad2/3结合的占位效应抑制其C末端的磷酸化。
4、在HEK293细胞中，PAK4抑制Smad2/3/4转录复合体的形成。
5、在胃癌BGC-823细胞中，PAK4抑制TGF-β1刺激后Smad2/3 C末端磷酸化的增加及入核。
6、在HEK293、BGC-823、HaCat及NMuMG细胞中，PAK4抑制Smad2/3的转录调控活性。
7、在HEK293细胞中，PAK4抑制TGF-β1下游靶基因PAI1 mRNA的表达。
8、在SGC-7901细胞中，沉默PAK4促进TGF-β1下游细胞周期相关蛋白的变化。
9、PAK4能够在体外磷酸化Smad2及Smad3。
结论：
1、PAK4在体内外与Smad2/3/4相互作用。
2、PAK4通过占位效应抑制TGF-β1刺激后Smad2/3 C末端的磷酸化，并进一步抑制Smad2/3/4转录复合体的形成及入核。
3、PAK4抑制Smad2/3的转录活性及TGF-β1/Smads对其下游基因的转录调控。
4、PAK4在体外磷酸化Smad2及Smad3。