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植物作为固定生长的生物,必须对外界变化的生长环境条件作出迅速反应以适应环境的改变。盐害、干旱及极端温度等非生物胁迫严重影响植物生长发育过程,是造成全球农业减产的重要因素。研究植物响应非生物胁迫反应的信号传导分子机理,对农作物的基因改良,提高主要作物对非生物胁迫的耐受能力,从而保持全球粮食的稳定供应有着重要的意义。
小G蛋白Ran是importinβ受体家族介导的核质间转运过程中一个必需的调控蛋白因子。此外它在细胞有丝分裂过程及分裂后核组装过程中也有重要作用。迄今为止,愈来愈多的研究报道表明,调控蛋白在核质间的分隔在植物生长发育及响应外界环境变化的信号传导过程中起重要的调控作用。我们研究发现Ran在植物生长发育和响应非生物胁迫过程中发挥重要作用。实验主要包括以下两个部分:
(1)水稻小G蛋白基因OsRAN2的功能研究。
关于植物中Ran的研究在拟南芥,西红柿,小麦中已有报道。而水稻中的这类蛋白目前为止还未有报道。我们实验结果发现:(ⅰ)水稻Ran家族(包括OsRAN1,OsRAN2和OsRAN3)与人类Ran/TC4以及拟南芥或者小麦中的同原物享有保守的蛋白序列和结构特征。OsRAN2主要定位在细胞核内,部分定位在细胞质中,这与动物细胞中Ran以RanGTP形式定位在细胞核内,以RanGDP形式定位在细胞质中的结果一致。(ⅱ)盐胁迫、渗透胁迫和外源ABA处理会下调OsRAN1和OsRAN2的转录表达。而且我们发现,ABA合成抑制剂氟啶酮会部分消除盐胁迫和渗透胁迫条件下OsRAN2的表达下降趋势,而外源添加ABA又会一定程度地恢复这种下调趋势。这就表明,OsRAN2在水稻响应非生物胁迫反应过程中的作用可能部分是通过ABA信号分子来介导的。另外我们还发现,外源水杨酸SA和茉莉酸JA处理也会下调OsRAN2的表达。(ⅲ)高表达OsRAN2的转基因水稻和拟南芥植株对这些非生物胁迫处理敏感。我们鉴定到在盐胁迫或者外源ABA处理条件下,胁迫响应基因AtNCED3、AtPLC1和AtMYB2在转基因拟南芥中有较高的诱导表达。玉米(Zea mays)转录因子Lc是一种入核转运的报告基因。而且高表达OsRAN2会破坏Lc在烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Gexin No.1)表皮细胞中的亚细胞定位,使得Lc不能完全定位到细胞核中。我们推测,高表达OsRAN2的转基因植株对胁迫反应的敏感,一方面是通过调节胁迫相应基因如AtNCED3、AtPLC1和AtMYB2的表达来实现的,另一方可能是由于一些重要调控蛋白在细胞核质间的转运被破坏而导致的。(ⅳ)OsRAN2高表达和RNAi(RNA interference)的转基因水稻植株还表现出多种生长发育表型。如高表达OsRAN2的转基因植株抽穗要比野生型植株晚；RNAi转基因植株为雄性不育,且分蘖不正常,花序发育不正常等等。我们推测,OsRAN2的过量表达或者OsRAN1-2下调表达很可能引起了转基因植株中不正常的RanGTPase循环,从而造成了不正常的核质间转运、细胞有丝分裂等过程,最终使得转基因植株表现出一系列的生长发育表型。
(2)拟南芥Ran家族参与的非生物胁迫反应
有报道称,拟南芥中AtRAN1,AtRAN2和AtRAN3可能参与了光受体介导的植物光信号传导途径。我们实验发现,在盐胁迫和外源ABA处理条件下,AtRAN1,AtRAN2和AtRAN3表达被上调。而且双突变体ran1/ran3-1,ran-1/ran3-2,ran2/ran3-1和ran2/ran3-2表现出对盐胁迫和ABA处理的敏感。这些结果表明AtRAN1,AtRAN2和AtRAN3在拟南芥植株对非生物胁迫反应过程中起重要调控作用。我们推测,AtRAN1,AtRAN2和AtRAN3突变后,影响importinβ受体家族介导胁迫调控因子的核质间转运过程,最终引起了双突变体对非生物胁迫的敏感表型。