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目的:不同的T细胞亚群在动脉粥样硬化进展过程中起不同的作用。辅助性T细胞和调节性T细胞在动脉粥样硬化斑块中起完全相反的作用。为了明确1型辅助性T细胞和新发现的调节性T细胞,CD4+CD25+Foxp3+T细胞亚群在冠心病患者疾病发展中的作用,我们分析了冠心病患者和健康对照组外周血中1型辅助性T细胞和CD4+CD25+Foxp3+T细胞与冠心病进展之间的关系。方法:1)研究对象及外周血单个核细胞的分离。本实验共选取了58名冠心病患者(稳定性心绞痛组18例,不稳定性心绞痛组16例,心肌梗死组24例)和健康对照组12例。研究对象入选后即抽取外周静脉血,经密度梯度离心法分离单个核细胞。2)流式细胞分析法分析外周血1型和2型辅助性T细胞。标本单个核细胞在37°C/5% CO2由刺激剂刺激4小时。刺激后的标本进行膜表面分子CD3的荧光染色。破膜后进行胞内细胞因子IFN-γ和IL-4的免疫荧光染色。染色完毕,将标本进行流式细胞分析。结果表示为CD3+T细胞亚群中细胞因子染色阳性的细胞百分比。3)ELISA法检测研究对象外周血浆中的IFN-γ,IL-2,IL-10和IL-4的浓度。标本抗凝后立即离心,收集血浆立即保存于–80°C。检测时复融,应用ELISA检测试剂盒检测标本中的细胞因子浓度。4)流式细胞分析法分析外周CD4+CD25+Foxp3+T调节性T细胞。将研究对象外周血单个核细胞在染色缓冲液中重悬,应用人体调节性T细胞流式染色试剂盒进行染色。染色完成后进行流式细胞仪分析,将CD4+CD25+T细胞亚群中检测6000个细胞。结果表示为其中Foxp3阳性的细胞百分比。5)CD4+CD25+T细胞的分选和rt-PCR检测其Foxp3的表达。应用CD4+CD25+免疫磁珠分选试剂盒分选CD4+CD25+T细胞,分选后的细胞的纯度由流式细胞仪验证。应用rt-PCR的方法检测分选细胞亚群Foxp3的表达。结果:1)研究对象的一般信息。健康对照组,稳定性心绞痛组,不稳定性心绞痛组,心肌梗死组在年龄,性别,血脂,血糖,高血压和吸烟等危险因素方面都无明显差异。2)各组CD3+T细胞亚群中1型和2型辅助性T细胞的频率。健康对照组Th1细胞百分比为6.81±1.43%,SA组Th1细胞百分比为5.91±0.92%,UA组Th1细胞百分比为19.71±5.14%,MI组Th1细胞百分比为29.40±5.81%。ACS(UA组与MI组)患者Th1细胞百分比较SA和健康对照组明显升高,(P<0.001),MI组Th1细胞百分比较UA组亦有明显升高(P<0.01),而SA组与健康对照组之间并无明显差异(P>0.05)。健康对照组Th2细胞百分比为0.79±0.19%,SA组Th2细胞百分比为0.79±0.25%,UA组Th2细胞百分比为0.69±0.22%,MI组Th2细胞百分比为0.73±0.21%。各组之间并无明显差异(P>0.05)。3)各组外周血1型和2型辅助性T细胞相关细胞因子的浓度。健康对照组IFN-γ血浆浓度为42.71±12.58 pg/ml , SA组为47.56±20.21 pg/ml , UA组为125.84±41.14 pg/ml,MI组为134.74±43.34 pg/ml。ACS(UA组和MI组)患者较SA组和健康对照组IFN-γ水平明显升高(P<0.001)。ACS两个亚组之间无显著性差异,SA组与健康对照组亦无显著性差异(P>0.05)。健康对照组IL-2血浆浓度为50.48±20.06pg/ml , SA组为46.21±16.72pg/ml , UA组为77.31±26.40pg/ml,MI组为87.93±16.40pg/ml。ACS(UA组和MI组)患者较SA组和健康对照组IL-2水平明显升高(P<0.001)。ACS两个亚组之间无显著性差异,SA组与健康对照组亦无显著性差异(P>0.05)。健康对照组IL-10血浆浓度为35.99±5.64pg/ml , SA组为27.51±5.53pg/m , UA组为19.11±3.53pg/ml,MI组为15.14±4.06pg/ml。冠心病患者血浆中IL-10水平逐渐下降,各组之间均有显著差异(P<0.001)。所有研究对象血浆IL-4水平均低于试剂盒的检测下限。4)各组CD4+CD25+T细胞亚群中Foxp3+T细胞的频率。CD4+CD25+T细胞亚群在PBMC中的比例在健康对照组和冠心病患者中无明显变化,健康对照组为6.80±1.15%,SA组为6.33±1.39%,UA组为6.57±1.24%,MI组中为6.93±1.16%,各组之间P>0.05。Foxp3+T细胞在CD4+CD25+T细胞亚群中的比例在健康对照组中为84.78±6.15%,在SA组中为71.75±8.05%,在UA组中为51.77±7.07%,在MI组中为40.43±5.73%。Foxp3+T细胞的比例在冠心病患者中相对于健康对照组明显降低,P<0.001,并且随着冠心病的进展逐渐降低,SA组、UA组和MI组之间均有明显差异,P<0.001。5)各组CD4+CD25+T细胞亚群中Foxp3mRNA的表达。Foxp3和β-actin的RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后,均只有一条带,与预期长度相吻合,说明均为特异性扩增片段。对琼脂糖凝胶电泳图谱上基因条带进行图像分析,计算Foxp3和β-actin吸收峰面积比值,健康对照组为0.925±0.045,SA组为0.730±0.053,UA组为0.577±0.054,MI组为0.350±0.078,各组之间均有统计学差异,P<0.001。结论:本实验研究发现随着动脉粥样硬化斑块不稳定的加剧,1型辅助性T细胞的数量急剧扩增,CD4+CD25+Tregs的数量随之下降。本实验首次证明促动脉粥样硬化的1型辅助性T细胞和抑制动脉粥样硬化的固有调节性T细胞的不平衡可能参与了斑块的不稳定,导致冠心病的进展。这为调节动脉粥样硬化的进程,稳定粥样硬化斑块提供了新的思路。