论文部分内容阅读
鼻咽癌的发生、发展与遗传因素、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染和环境因素及三者之间的相互作用密切相关。EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)，即人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus4，HHV-4)，是一种嗜B淋巴细胞的DNA病毒，属于疱疹病毒科γ亚科。其感染与多种疾病发生有关，尤其与肿瘤的发生密切相关，包括淋巴瘤类，上皮肿瘤（鼻咽癌、胃腺癌、肺癌及乳腺癌等）以及胸腺瘤、平滑肌瘤、肝肉瘤等。国际癌症研究机构（IARC）已将其列为Ⅰ类致癌物质。1966年Old LJ等人首次在鼻咽癌患者血清中检测到EB病毒抗体，此后在1969年有研究人员从鼻咽癌活检组织培养出的类淋巴母细胞中分离到EB病毒。此外，最早期的鼻咽癌病变（重度异型性变/原位癌）已经出现EB病毒潜伏性、克隆性病毒基因组及表达病毒的原癌蛋白如潜伏膜蛋白1(LMP1)，而在正常或低度异型性变的鼻咽上皮则未发现EB病毒感染。从而提示，EB病毒在鼻咽癌发生、发展过程中起到非常重要的作用。 近半个世纪以来，EB病毒血清学检测已广泛运用于鼻咽癌的早期筛查和早期诊断。从最开始的免疫酶法(IEA)检测单一抗体的研究，到后来逐步发展的酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同EBV血清学抗体，并从单一抗体逐步发展到“串联”或“并联”检测多个EBV抗体，以增加鼻咽癌辅助诊断的特异性或敏感性。随着研究的深入，EBV检测抗体的种类也涵盖了IgG和IgA，EBV裂解周期以及潜伏周期的更多种类抗原相关的抗体也被用于鼻咽癌的诊断性研究。但是EBV抗体的发展仍受到诸多限制，如特异性不高，很多VCA-IgA或EBNA1-IgA阳性人群中只有极少数为真正的鼻咽癌高风险患者，而绝大多数均为假阳性，因此亟待解决的问题仍是寻找新的鼻咽癌筛查或早期诊断的标志物，更好地服务于鼻咽癌防治工作。 上个世纪中期开始，血液循环中游离DNA在各类疾病、尤其是恶性肿瘤的研究中逐渐受到重视。对于鼻咽癌而言，上世纪90年代，研究人员在血液循环中检测到游离的EBV-DNA片段，为鼻咽癌的分子诊断提供了新的、有重要价值的工具，直到今日仍是临床研究的热点。但是目前来说，血浆游离EBV-DNA的临床检测还存在一些问题，如对于早期鼻咽癌的诊断效能较差，仍有一定的误诊率等，因此仍需进一步研究。 在论文的第一部分，我们通过回顾性的鼻咽癌病例的EBV-DNA临床辅助诊断研究，分析EBV-DNA定量检测用于鼻咽癌患者检测的价值，并通过一些合作性研究，寻求敏感性和特异性更高的EBV-DNA检测的引物和探针，为鼻咽癌的早期诊断提供新的工具。第二部分则以EBV-DNA联合多个新合作开发的EBV血清学抗体用于检测早期鼻咽癌患者，以期提高早期鼻咽癌患者的检出率。 第一部分：临床初治NPC患者的EBV-DNA定量结果分析 目的： 本研究主要通过回顾性分析临床收治的初治鼻咽癌患者的血浆游离EBV-DNA结果和前瞻性探索EBV-DNA联合血清学抗体是否能够提高早期鼻咽癌的诊断效能，为鼻咽癌的早期诊疗提供一些实验数据。 方法： 本研究对2013年8月至2015年11月在广东省中山市人民医院收治住院的初治鼻咽癌患者（417例）的EBV-DNA定量结果进行回顾性分析。其中男性305人，女性112人。另外，选取鼻咽癌筛查人群211例和耳鼻喉科送检、最终病理确诊为鼻咽炎的患者（95例）作为两个对照组，应用荧光定量PCR法(Taqman探针法)检测EBV-DNA含量，计算敏感性、特异性及阳性预测值、阴性预测值等，总结EBV-DNA用于早期鼻咽癌诊断的临床价值以及分析目前EBV-DNA定量检测的局限性。 结果： (1)一般资料分析。417例初治鼻咽癌患者，均经本院或外院病理诊断，证实为非角化性癌。TNM分期采用2008福州分期。其中男性305例，女性112例（男:女=2.72∶1）。患者年龄范围从17岁到83岁，平均年龄48.3岁。具体临床特征资料见表1。 (2)EBV-DNA结果分析。首先比较不同群组患者的EBV-DNA阳性检出率。结果发现，随着临床分期增加，EBV-DNA的阳性检出率不断提高（Ⅰ期阳性率为39.2％，Ⅱ期阳性率为65.6％，Ⅲ期和Ⅳ期阳性率分别为88.3％和94.1％）。同样，对于T、N、M分期均可以发现类似趋势。对于不同临床分期患者的EBV-DNA结果进行比较发现，随着临床分期增加，EBV-DNA含量逐渐增高(P＜0.01)。对于T分期，T1+T2明显低于T3+T4(P＜0.01)。N分期而言，N0、N1和N2之间并无显著差别，而N3则较前三者具有显著性差异(P＜0.05)。对于M分期，M1显著高于M0平均水平，并具有显著性差异(P＜0.05)。 (3)耳鼻喉科送检鼻咽镜下鼻咽肿物患者标本EBV-DNA分析。2013年8月到2015年11月，共收取耳鼻咽喉科送检疑似患者血浆标本119例，其中确诊鼻咽癌24例，鼻咽慢性炎症95例。95例鼻咽炎中仅有2例出现EBV-DNA阳性。24例鼻咽癌出现的4例EBV-DNA阴性患者中，1例为角化性癌，其余3例均为临床Ⅰ期患者（未分化型非角化性癌）。EBV-DNA检测的敏感度为83.3％(20/24)，特异性为97.9％(93/95)，阳性预测值为90.9％(20/22)，阴性预测值为95.9％(93/97)。 结论： (1)本院收治的初治鼻咽癌患者的性别比例符合鼻咽癌发病一般性别特征，男性显著多余女性。鼻咽癌的高发年龄段也集中于45到60岁，之后发病率逐渐下降。 (2)初治鼻咽癌患者的EBV-DNA阳性检出率会随临床分期的增加而增加。初治患者的EBV-DNA含量也随着临床分期的增加而增高，早期(Ⅰ+Ⅱ)病例的血浆EBV-DNA水平显著低于中晚期(Ⅲ+Ⅳ)。但对于单独的N分期而言，其水平并未随着分期增加而显著增高，只有N3的EBV-DNA水平显著高于N0～N2。而对于M分期，M1患者出现远处转移，其EBV-DNA水平显著高于未转移的M0患者。 (3)对于耳鼻喉科收治的鼻咽肿块、疑似肿瘤患者，EBV-DNA的阴性预测值和特异度都非常高，均大于95％这意味着EBV-DNA(-)，肿块性质为鼻咽癌的可能性很小。因此EBV-DNA定量检测对于初步鉴别鼻咽肿块的性质具有很好的参考价值。 第二部分：EBV-DNA联合EBNA1、TK用于鼻咽癌辅助诊断的研究 目的： EB病毒血清学检测是鼻咽癌筛查和辅助诊断的常规手段，随着技术的进步，多种EB病毒相关抗原抗体检测的敏感度和特异度都已经达到90％以上。尽管如此，EB病毒血清学作为鼻咽癌辅助诊断指标，其假阳性率较高的问题没有得到很好的解决。如何提高其检测特异度、降低假阳性率仍是需要深入探讨的问题。发展更多种类的EB病毒血清学抗体是一种很好的解决方案。血浆游离EBV-DNA定量检测是上世纪末、本世纪初发展起来的一种新的检测方法，其敏感度和特异度均较高。尤其在特异度方面显示出良好的效能，为鼻咽癌的辅助诊断提供了潜在的新手段。本研究采用实时荧光定量PCR法检测临床初诊鼻咽癌患者血浆中游离EBV-DNA，并同EB病毒血清学抗体联合，以探讨血浆EBV-DNA组合EBV抗体在鼻咽癌筛查、早期诊断中的应用价值。 方法： 研究对象来自于中山市人民医院住院的初治鼻咽癌患者。采集患者外周血2ml，离心得到血浆和血清，收集的血浆采用荧光定量PCR方法检测游离EBV-DNA;血清标本使用ELISA法检测EBNA1/IgA、EBNA2/IgA、Zta/IgA、EA-R/IgA、EA-D/IgA、TK/IgA和VCAp18/IgA和抗体。结合血清学的动态变化，分析并寻找出鼻咽癌诊断的最佳指标或组合，并同EBV-DNA相结合，进一步提高其诊断效能。 结果： (1)7种EBV抗原通过克隆、纯化获得。重组抗原纯化效率大于90％。每种均与EBV血清学阳性血清反应，而不与阴性血清反应。 (2)采用上述抗体检测347例健康人和188例初治鼻咽癌患者的标本，结果发现，EBNA1/IgA和TK/IgA对于鼻咽癌诊断具有最高的AUC曲线面积，分别达到0.940(0.920-0.961)和0.945(0.923-0.967)，对于隐匿性鼻咽癌，EBNA1/IgA的预测价值也达到AUC曲线面积0.959(0.936-0.983)，显示出良好的临床应用潜力。EBNA2/IgA和TK/IgA则对于鼻咽癌的转移预测具有非常好的参考意义。 (3)选用上述EBNA1/IgA和TK/IgA，分别联合EBV-DNA用于早期鼻咽癌的诊断。结果发现，EBNA1联合TK，其诊断灵敏度可达98.4％，但特异性较差;而EBV-DNA联合EBNA1，其诊断灵敏度可达93％，特异度100％。 结论： 成功制备的7种EBV抗原的相应IgA抗体均显示出一定的临床应用潜力，尤其对于EBNA1/IgA和TK/IgA，单独使用可达到非常高的鼻咽癌预测价值，而联合EBV-DNA可以进一步提高早期鼻咽癌的诊断效能。