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目的：
胎盘是联系母胎之间的桥梁，是胎儿正常生长发育的组织学基础。在胎盘形成过程中，胎儿源性滋养细胞对母体的适度侵袭起到关键作用。滋养细胞虽然具有类似恶性肿瘤细胞的侵袭能力，但其侵袭过程受到了机体严密的调控，称之为节制性侵袭。若滋养细胞对母体的侵袭过程发生异常，将会导致严重的妊娠期相关疾病，但是滋养细胞节制性侵袭的调控机制十分复杂，至今仍未完全阐明，需要深入探究。大量研究显示，子宫蜕膜基质细胞在滋养细胞侵袭的调控过程中发挥关键作用，但是其具体作用机制仍不清楚，其分泌的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，Evs)可能在滋养细胞功能调控过程中起到重要作用。
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是细胞分泌的脂质双分子层囊泡状小体，主要分为外泌体与微囊泡两大类。EVs内含有大量信号转导因子，可以与靶细胞相互作用调控其功能，参与多种病理生理过程。研究显示，EVs在妊娠中发挥重要作用，与妊娠期相关疾病的发生与发展密切相关，但是其在妊娠过程中所发挥的作用还需要深入探究。EVs的来源十分广泛，几乎机体所有的细胞均能分泌。在滋养细胞侵袭调控过程中发挥关键作用的子宫蜕膜基质细胞是否也可以分泌EVs，且子宫蜕膜基质细胞是否可以通过分泌EVs参与滋养细胞功能调控，目前未见相关报道。
本文着重探讨了子宫蜕膜基质细胞来源EVs对滋养细胞侵袭作用的影响，并探讨其影响滋养细胞功能的具体分子机制。这为进一步探究滋养细胞适度侵袭的调控机制提供了一个新的方向，并且为今后进一步阐明胎盘源性疾病，如子痫前期与胎儿生长发育受限的具体发病机制提供了新的思路。
方法：
1、子宫蜕膜基质细胞的诱导与其来源EVs的分离与鉴定
(1)选择子宫内膜基质细胞系(HESC)，体外诱导其蜕膜化后，利用分步超速离心法从收集的子宫蜕膜基质细胞培养上清液中获取子宫蜕膜细胞来源EVs。
(2)采用透射电镜与Western blot，对分离出的子宫蜕膜基质细胞来源EVs进行鉴定。
(3)利用PKH26细胞外囊泡染色实验，观察提取EVs与滋养细胞株HTR8/SVneo细胞之间的相互融合作用。
2、子宫蜕膜基质细胞来源EVs通过介导上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)促进滋养细胞侵袭
(1)Transwell小室侵袭实验检测不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs对人滋养细胞株-HTR8/SVneo侵袭能力的影响。
(2)利用Western blot检测不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs对HTR8/SVneo细胞EMT标志物的影响。
(3)采用不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs处理HTR8/SVneo后，利用细胞免疫荧光实验，检测细胞EMT标志蛋白N-cadherin的表达变化情况。
(4)分选并鉴定人原代绒毛外滋养细胞，利用荧光定量PCR以及Western blot检测不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs对人原代绒毛外滋养细胞EMT重要标记蛋白N-cadherin表达的影响。
3、子宫蜕膜基质细胞来源EVs通过Smad2/3-N-cadherin信号通路增强滋养细胞的侵袭能力
(1)利用siRNA干扰HTR8/SVneo细胞中N-cadherin的表达，并利用荧光定量PCR与Western blot对干扰效果进行验证。
(2)利用Transwell小室侵袭实验，检测不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs对转染si-N-cad的HTR8/SVneo细胞侵袭作用的影响。
(3)利用Western blot检测子宫蜕膜基质细胞来源EVs刺激后HTR8/SVneo细胞磷酸化与总的Smad2/3表达水平。
(4)采用siRNA干扰HTR8/SVneo细胞Smad2/3的表达，并且利用荧光定量PCR对敲除效果进行验证。
(5)利用荧光定量PCR以及Western blot检测子宫蜕膜基质细胞来源EVs对转染了si-Smad2/3的HTR8/SVneo细胞N-cadherin表达的影响。
(6)高通量测序分析子宫内膜基质细胞与子宫蜕膜基质细胞来源EVs内miRNA的组成，分析其候选靶基因参与调控的主要的信号通路。
结果：
1、体外成功诱导子宫内膜基质细胞蜕膜化，获取并鉴定其来源细胞外囊泡。
2、采用Transwell小室侵袭实验证实子宫蜕膜基质细胞来源EVs显著促进滋养细胞株HTR8/SVneo细胞侵袭(P＜0.001)。
3、Western blot与细胞免疫荧光实验证明子宫蜕膜基质细胞来源EVs显著影响细胞EMT的相关标记物表达，E-cadherin表达下降，N-cadherin表达升高。表明子宫蜕膜基质细胞来源EVs可以促进HTR8/SVneo细胞发生EMT。
4、EMT重要标志物N-cadherin蛋白在子宫蜕膜基质细胞来源EVs促进滋养细胞侵袭作用中发挥关键作用。
5、子宫蜕膜基质细胞来源EVs促进HTR8/SVneo细胞N-cadherin表达升高是通过活化转录因子Smad2/3。
6、高通量测序检测子宫蜕膜基质细胞来源EVs中含有多种miRNA，与多条影响细胞迁移与侵袭的分子信号通路调控有关。
结论：
1、子宫蜕膜基质细胞可以分泌EVs并且能够与人滋养细胞株-HTR8/SVneo细胞发生相互作用。
2、子宫蜕膜基质细胞来源EVs可以显著增强HTR8/SVneo细胞的侵袭能力，该增强效应与子宫蜕膜基质细胞来源EVs促进HTR8/SVneo细胞发生EMT密切相关。
3、子宫蜕膜基质细胞来源EVs主要通过上调HTR8/SVneo细胞N-cadherin的表达来促进HTR8/SVneo细胞侵袭。
4、子宫蜕膜基质细胞来源EVs通过活化转录因子Smad2/3介导HTR8/SVneo细胞N-cadherin表达的上调。
5、高通量测序显示子宫蜕膜基质细胞来源EVs中富含miRNA，并且其对应的候选靶基因与多条调控细胞迁移与侵袭的分子信号通路有关，从而可以影响包括细胞侵袭在内的多种细胞生理特性。
胎盘是联系母胎之间的桥梁，是胎儿正常生长发育的组织学基础。在胎盘形成过程中，胎儿源性滋养细胞对母体的适度侵袭起到关键作用。滋养细胞虽然具有类似恶性肿瘤细胞的侵袭能力，但其侵袭过程受到了机体严密的调控，称之为节制性侵袭。若滋养细胞对母体的侵袭过程发生异常，将会导致严重的妊娠期相关疾病，但是滋养细胞节制性侵袭的调控机制十分复杂，至今仍未完全阐明，需要深入探究。大量研究显示，子宫蜕膜基质细胞在滋养细胞侵袭的调控过程中发挥关键作用，但是其具体作用机制仍不清楚，其分泌的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，Evs)可能在滋养细胞功能调控过程中起到重要作用。
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是细胞分泌的脂质双分子层囊泡状小体，主要分为外泌体与微囊泡两大类。EVs内含有大量信号转导因子，可以与靶细胞相互作用调控其功能，参与多种病理生理过程。研究显示，EVs在妊娠中发挥重要作用，与妊娠期相关疾病的发生与发展密切相关，但是其在妊娠过程中所发挥的作用还需要深入探究。EVs的来源十分广泛，几乎机体所有的细胞均能分泌。在滋养细胞侵袭调控过程中发挥关键作用的子宫蜕膜基质细胞是否也可以分泌EVs，且子宫蜕膜基质细胞是否可以通过分泌EVs参与滋养细胞功能调控，目前未见相关报道。
本文着重探讨了子宫蜕膜基质细胞来源EVs对滋养细胞侵袭作用的影响，并探讨其影响滋养细胞功能的具体分子机制。这为进一步探究滋养细胞适度侵袭的调控机制提供了一个新的方向，并且为今后进一步阐明胎盘源性疾病，如子痫前期与胎儿生长发育受限的具体发病机制提供了新的思路。
方法：
1、子宫蜕膜基质细胞的诱导与其来源EVs的分离与鉴定
(1)选择子宫内膜基质细胞系(HESC)，体外诱导其蜕膜化后，利用分步超速离心法从收集的子宫蜕膜基质细胞培养上清液中获取子宫蜕膜细胞来源EVs。
(2)采用透射电镜与Western blot，对分离出的子宫蜕膜基质细胞来源EVs进行鉴定。
(3)利用PKH26细胞外囊泡染色实验，观察提取EVs与滋养细胞株HTR8/SVneo细胞之间的相互融合作用。
2、子宫蜕膜基质细胞来源EVs通过介导上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)促进滋养细胞侵袭
(1)Transwell小室侵袭实验检测不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs对人滋养细胞株-HTR8/SVneo侵袭能力的影响。
(2)利用Western blot检测不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs对HTR8/SVneo细胞EMT标志物的影响。
(3)采用不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs处理HTR8/SVneo后，利用细胞免疫荧光实验，检测细胞EMT标志蛋白N-cadherin的表达变化情况。
(4)分选并鉴定人原代绒毛外滋养细胞，利用荧光定量PCR以及Western blot检测不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs对人原代绒毛外滋养细胞EMT重要标记蛋白N-cadherin表达的影响。
3、子宫蜕膜基质细胞来源EVs通过Smad2/3-N-cadherin信号通路增强滋养细胞的侵袭能力
(1)利用siRNA干扰HTR8/SVneo细胞中N-cadherin的表达，并利用荧光定量PCR与Western blot对干扰效果进行验证。
(2)利用Transwell小室侵袭实验，检测不同浓度子宫蜕膜基质细胞来源EVs对转染si-N-cad的HTR8/SVneo细胞侵袭作用的影响。
(3)利用Western blot检测子宫蜕膜基质细胞来源EVs刺激后HTR8/SVneo细胞磷酸化与总的Smad2/3表达水平。
(4)采用siRNA干扰HTR8/SVneo细胞Smad2/3的表达，并且利用荧光定量PCR对敲除效果进行验证。
(5)利用荧光定量PCR以及Western blot检测子宫蜕膜基质细胞来源EVs对转染了si-Smad2/3的HTR8/SVneo细胞N-cadherin表达的影响。
(6)高通量测序分析子宫内膜基质细胞与子宫蜕膜基质细胞来源EVs内miRNA的组成，分析其候选靶基因参与调控的主要的信号通路。
结果：
1、体外成功诱导子宫内膜基质细胞蜕膜化，获取并鉴定其来源细胞外囊泡。
2、采用Transwell小室侵袭实验证实子宫蜕膜基质细胞来源EVs显著促进滋养细胞株HTR8/SVneo细胞侵袭(P＜0.001)。
3、Western blot与细胞免疫荧光实验证明子宫蜕膜基质细胞来源EVs显著影响细胞EMT的相关标记物表达，E-cadherin表达下降，N-cadherin表达升高。表明子宫蜕膜基质细胞来源EVs可以促进HTR8/SVneo细胞发生EMT。
4、EMT重要标志物N-cadherin蛋白在子宫蜕膜基质细胞来源EVs促进滋养细胞侵袭作用中发挥关键作用。
5、子宫蜕膜基质细胞来源EVs促进HTR8/SVneo细胞N-cadherin表达升高是通过活化转录因子Smad2/3。
6、高通量测序检测子宫蜕膜基质细胞来源EVs中含有多种miRNA，与多条影响细胞迁移与侵袭的分子信号通路调控有关。
结论：
1、子宫蜕膜基质细胞可以分泌EVs并且能够与人滋养细胞株-HTR8/SVneo细胞发生相互作用。
2、子宫蜕膜基质细胞来源EVs可以显著增强HTR8/SVneo细胞的侵袭能力，该增强效应与子宫蜕膜基质细胞来源EVs促进HTR8/SVneo细胞发生EMT密切相关。
3、子宫蜕膜基质细胞来源EVs主要通过上调HTR8/SVneo细胞N-cadherin的表达来促进HTR8/SVneo细胞侵袭。
4、子宫蜕膜基质细胞来源EVs通过活化转录因子Smad2/3介导HTR8/SVneo细胞N-cadherin表达的上调。
5、高通量测序显示子宫蜕膜基质细胞来源EVs中富含miRNA，并且其对应的候选靶基因与多条调控细胞迁移与侵袭的分子信号通路有关，从而可以影响包括细胞侵袭在内的多种细胞生理特性。