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目的:
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤，是世界范围内威胁人类健康的问题，尽早的发现、诊断和治疗将会提高患者的生存质量与生存时间，对结直肠癌的临床诊疗有重大意义。表观遗传内容发生异常的时间早于基因突变和基因组不稳定性的发生，通过靶向microRNA和DNA甲基化进行检测和治疗对肿瘤早期的筛查和防治有重要意义。本研究通过microRNA芯片和生物信息学方法筛选出结直肠癌相关microRNA，并探讨它们在结直肠癌发生和发展中的作用。并通过建立结直肠癌组织块体外培养实验体系探讨microRNA和DNA甲基化之间的关系以及左金丸的主要成分吴茱萸碱和小檗碱的干预效应。
方法:
利用生物信息学方法对从GEO数据库中获取的人结肠癌组织块、人结肠癌细胞系、小鼠结肠癌模型的基因表达数据进行分析，探讨这三种不同的实验对象间存在的差异，筛选并确定适合于后续实验的实验对象。
从临床手术获取距结直肠癌病灶不同距离的肠上皮组织样本，分别为正常组织(距肿瘤大于等于10cm)，癌旁组织(距肿瘤约2cm)和肿瘤组织。对取得的组织进行石蜡切片处理后通过HE染色以对比分析不同部位间的组织结构差异，通过对细胞黏附分子E-cadherin，细胞极性调控蛋白Crumbs3，间质性标志物α-SMA和Vimentin进行免疫组织化学（Immunohistochemistry）检测探讨结直肠癌癌变过程中细胞表型的转变及其意义。
将临床外科手术取得人结直肠癌样本进行microRNA芯片检测，并对差异表达的microRNA进行生物信息分析。在差异表达的microRNA中筛选出能够靶向调控甲基转移酶的microRNA，并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)对其进行验证。
将临床取得的组织块进行体外贴壁培养，分别加入不同浓度的小檗碱(4μmol/L，8μmol/L，16umμmol/L)和吴茱萸碱(3μmol/L，6μmol/L，12μmol/L)，药物处理72h后通过qRT-PCR检测hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p的表达情况，探讨吴茱萸碱和小檗碱对结直肠癌相关microRNA的调控作用。为了探索DNA甲基化和microRNA之间的相互作用，在体外培养的组织块中加入DNA甲基化抑制剂地西他滨(5-Aza-2-deoxycytidine，DAC)，然后通过qRT-PCR检测hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p的表达情况;加入microRNA拮抗剂antagomir后通过免疫印迹(Western blotting)对DNMT1和E-cadherin的蛋白表达进行测定。
结果:
(1)人结肠癌细胞系和小鼠结肠癌模型的基因表达情况和富集的信号转导通路结果与人结肠癌组织块的数据结果存在差异。结合本研究的实验目的，选用人组织块进行后续的实验研究。
(2)HE染色结果提示距离结肠癌肿瘤部位不同距离的组织结构存在较大差异，在结直肠癌肿瘤组织中，出现了大量的异常隐窝病灶，隐窝结构明显不同于正常组织，而且在癌旁组织中也出现了部分异常的隐窝结构。
(3)细胞黏附分子E-cadherin和细胞极性调控蛋白Crumbs3在结直肠癌中低表达，间质性标志物Vimentin和α-SMA在结直肠癌中高表达。
(4)识别距结直肠癌病灶不同距离的肠上皮组织的microRNA表达谱，筛选出在结直肠癌中能靶向调控甲基转移酶的差异表达microRNA。在癌旁组织对比远端正常组织，肿瘤组织对比癌旁组织，肿瘤组织对比远端正常组织这三组结果中，肿瘤组织对比远端正常组织的差异表达基因个数最多。qRT-PCR验证结果显示hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p在结直肠癌中表达差异具有统计学意义，靶基因预测结果提示它们参与调控众多靶基因，对肿瘤的发生发展有重要作用。
(5)与空白对照组相比，在分别使用地西他滨、小檗碱和吴茱萸碱处理后，hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p表达发生了明显变化，且在三个部位间的表达差异有所缩小。在加入hsa-miR-429拮抗剂处理后，DNMT1表达上调，E-cadherin改变不明显。
结论:
(1)肿瘤组织、癌旁组织与远端正常组织间的隐窝结构和microRNA表达情况都存在较大差异。癌旁组织既不同于肿瘤组织，也区别于正常组织。
(2)结直肠癌癌变过程中出现了细胞极性的丢失，细胞间黏附力的下降和间质细胞增多，这些改变最终将会引发细胞表型的改变。
(3)Hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p在结直肠癌中表达差异显著，参与调控肿瘤细胞的增殖，凋亡，转移和耐药性等，对肿瘤的诊断和治疗等都有潜在临床应用价值。Hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p能靶向调控甲基转移酶，microRNA的异常可能是肿瘤中的DNA甲基化水平发生改变的原因之一。
(4)小檗碱和吴茱萸碱可能通过对结直肠癌相关microRNA的调控作用从而影响microRNA靶基因的表达及功能，这可能是小檗碱和吴茱萸碱的抗肿瘤作用机制之一。
(5)DNA甲基化和microRNA之间存在一定的相互调控关系，这种关系的平衡对维持机体的正常生理机能及肿瘤的发生发展有重要意义。
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤，是世界范围内威胁人类健康的问题，尽早的发现、诊断和治疗将会提高患者的生存质量与生存时间，对结直肠癌的临床诊疗有重大意义。表观遗传内容发生异常的时间早于基因突变和基因组不稳定性的发生，通过靶向microRNA和DNA甲基化进行检测和治疗对肿瘤早期的筛查和防治有重要意义。本研究通过microRNA芯片和生物信息学方法筛选出结直肠癌相关microRNA，并探讨它们在结直肠癌发生和发展中的作用。并通过建立结直肠癌组织块体外培养实验体系探讨microRNA和DNA甲基化之间的关系以及左金丸的主要成分吴茱萸碱和小檗碱的干预效应。
方法:
利用生物信息学方法对从GEO数据库中获取的人结肠癌组织块、人结肠癌细胞系、小鼠结肠癌模型的基因表达数据进行分析，探讨这三种不同的实验对象间存在的差异，筛选并确定适合于后续实验的实验对象。
从临床手术获取距结直肠癌病灶不同距离的肠上皮组织样本，分别为正常组织(距肿瘤大于等于10cm)，癌旁组织(距肿瘤约2cm)和肿瘤组织。对取得的组织进行石蜡切片处理后通过HE染色以对比分析不同部位间的组织结构差异，通过对细胞黏附分子E-cadherin，细胞极性调控蛋白Crumbs3，间质性标志物α-SMA和Vimentin进行免疫组织化学（Immunohistochemistry）检测探讨结直肠癌癌变过程中细胞表型的转变及其意义。
将临床外科手术取得人结直肠癌样本进行microRNA芯片检测，并对差异表达的microRNA进行生物信息分析。在差异表达的microRNA中筛选出能够靶向调控甲基转移酶的microRNA，并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)对其进行验证。
将临床取得的组织块进行体外贴壁培养，分别加入不同浓度的小檗碱(4μmol/L，8μmol/L，16umμmol/L)和吴茱萸碱(3μmol/L，6μmol/L，12μmol/L)，药物处理72h后通过qRT-PCR检测hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p的表达情况，探讨吴茱萸碱和小檗碱对结直肠癌相关microRNA的调控作用。为了探索DNA甲基化和microRNA之间的相互作用，在体外培养的组织块中加入DNA甲基化抑制剂地西他滨(5-Aza-2-deoxycytidine，DAC)，然后通过qRT-PCR检测hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p的表达情况;加入microRNA拮抗剂antagomir后通过免疫印迹(Western blotting)对DNMT1和E-cadherin的蛋白表达进行测定。
结果:
(1)人结肠癌细胞系和小鼠结肠癌模型的基因表达情况和富集的信号转导通路结果与人结肠癌组织块的数据结果存在差异。结合本研究的实验目的，选用人组织块进行后续的实验研究。
(2)HE染色结果提示距离结肠癌肿瘤部位不同距离的组织结构存在较大差异，在结直肠癌肿瘤组织中，出现了大量的异常隐窝病灶，隐窝结构明显不同于正常组织，而且在癌旁组织中也出现了部分异常的隐窝结构。
(3)细胞黏附分子E-cadherin和细胞极性调控蛋白Crumbs3在结直肠癌中低表达，间质性标志物Vimentin和α-SMA在结直肠癌中高表达。
(4)识别距结直肠癌病灶不同距离的肠上皮组织的microRNA表达谱，筛选出在结直肠癌中能靶向调控甲基转移酶的差异表达microRNA。在癌旁组织对比远端正常组织，肿瘤组织对比癌旁组织，肿瘤组织对比远端正常组织这三组结果中，肿瘤组织对比远端正常组织的差异表达基因个数最多。qRT-PCR验证结果显示hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p在结直肠癌中表达差异具有统计学意义，靶基因预测结果提示它们参与调控众多靶基因，对肿瘤的发生发展有重要作用。
(5)与空白对照组相比，在分别使用地西他滨、小檗碱和吴茱萸碱处理后，hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p表达发生了明显变化，且在三个部位间的表达差异有所缩小。在加入hsa-miR-429拮抗剂处理后，DNMT1表达上调，E-cadherin改变不明显。
结论:
(1)肿瘤组织、癌旁组织与远端正常组织间的隐窝结构和microRNA表达情况都存在较大差异。癌旁组织既不同于肿瘤组织，也区别于正常组织。
(2)结直肠癌癌变过程中出现了细胞极性的丢失，细胞间黏附力的下降和间质细胞增多，这些改变最终将会引发细胞表型的改变。
(3)Hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p在结直肠癌中表达差异显著，参与调控肿瘤细胞的增殖，凋亡，转移和耐药性等，对肿瘤的诊断和治疗等都有潜在临床应用价值。Hsa-miR-429和hsa-miR-497-5p能靶向调控甲基转移酶，microRNA的异常可能是肿瘤中的DNA甲基化水平发生改变的原因之一。
(4)小檗碱和吴茱萸碱可能通过对结直肠癌相关microRNA的调控作用从而影响microRNA靶基因的表达及功能，这可能是小檗碱和吴茱萸碱的抗肿瘤作用机制之一。
(5)DNA甲基化和microRNA之间存在一定的相互调控关系，这种关系的平衡对维持机体的正常生理机能及肿瘤的发生发展有重要意义。