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本研究以6种转基因玉米(MON810、Bt11、Bt176、T25、GA21和NK603)为试验材料,研究适合的基因组DNA提取方法,建立和验证了转基因玉米定性PCR检测方法,并进一步对扩增的目的片段进行克隆、测序和BLAST同源性分析,制备出转基因玉米检测阳性样品。还利用定性PCR检测引物建立和优化了复合PCR检测体系,同时参考Kuntrudi等MQDA.PCR文献中设计的探针,将复合PCR和基因芯片结合起来,建立了高效、可靠的外源基因检测方法。得到的结论如下:
1、研究表明改良CTAB法提取的基因组DNA纯度高、质量好。用玉米内参照基因引物扩增改良CTAB法提取的基因组DNA,结果均为阳性,这能消除下游检测出现假阴性结果。
2、本研究对Kunt rudi等MQDA-PCR文献中设计的引物进行验证,验证结果表明35S-F/R、NOS-F/R、Bt11-F/R、Bt176-F/R、1725-F/R和MON810-F/R引物检测结果稳定,可以用于转基因玉米的定性检测,而GA21-F/R引物检测结果不稳定,本研究对其进行了改进,重新建立了稳定的定性PCR检测体系。
3、本研究还通过查询和收集转基因玉米NK603外源基因的构建信息,设计了NK603-F/R结构特异性引物,建立和优化了转基因玉米NK603定性PCR检测方法。
4、对8对定性PCR检测引物扩增得到的目的基因进行回收、克隆、测序与基因数据库比对,发现这些基因的特异片段就是检测的目标,因此可以将插入这些基因片段的质粒作为检测工作中的阳性对照。
5、本研究利用定性PCR检测的引物,设计和优化了复合PCR反应体系,能同时在一个PCR反应中最多扩增出6种转基因玉米的特异性片段。
6、利用Kunt rudi等MQDA-PCR文献中设计的探针,将复合PCR和基因芯片结合起来,同时检测6种转基因玉米的8个外源基因元件,包括CaMV35S基因、NOS基因、MaizeDNA/P-35S基因、P-35S/IVS2基因、PEPC/CrylAb基因、PAT/T-35S基因、M-EPSPS基因和hsp70/ctp2基因,达到了高效、准确的检测目的。