论文部分内容阅读
高产、优质是粮食生产的最终目标。作为重要的农艺性状，株高对作物产量潜力和抗倒伏能力有着重要影响，适当矮化可以提高收获指数。在小麦育种中，合理利用矮秆基因Rht-1是提高产量的切入点之一，而Rht-1基因调控小麦株高的分子机理与GA信号传导途径密切相关。因此，明确Rht-1基因所编码DELLA蛋白在GA信号传导通路中的调控机制，解析Rht-1基因调控株高的机理，对于在小麦品种改良中更有效地利用矮秆基因具有重要的理论和实践意义。本文主要研究Rht-1新等位变异调控小麦株高的分子机理，克隆了小麦TaGID2基因并对其与Rht-1新等位变异的相互作用进行了分析，探讨了Rht-1新等位变异所编码的DELLA蛋白的调控机制，对Rht-1新等位变异的启动子进行了克隆及功能分析，获得的主要研究结果如下: 1.小麦F-box基因TaGID2的克隆与功能研究 通过同源克隆方法，从小麦品种“中国春”中获得了3个TaG ID2基因的cDNA和基因组DNA序列。3个TaGID2基因均由2个外显子和1个内含子组成。利用中国春的一套缺体四体和片段缺失系将3个基因分别定位于3AS4-0.45-1.00、3BS-0.57-0.78和3DS4-0.59-1.00染色体区段上，并分别命名为TaGID2-A1、TaGID2-B1和TaGID2-D1。3个基因在小麦抽穗期呈组成性表达，在幼穗、穗下节、第三节间和第四节间等部位表达水平较高，在旗叶和根中表达水平较低，并且受GA诱导表达下调。酵母双杂交检测发现，TaGID2蛋白通过与SKP1/ASK1相似蛋白TSK1相互作用形成SCF复合体;此外，TaGID2蛋白与Rht-A1a、Rht-B1a及Rht-D1a所编码的DELLA蛋白在细胞核内存在着不依赖于GA的互作，其中，TaGID2-A1与RHT-A1a、RHT-B1a、RHT-D1a的亲和能力更强。 2.小麦Rht-1新等位基因所编码DELLA蛋白的调控机制 酵母双杂交和双分子荧光互补技术检测发现，GA不存在时，RHT-1s与TaGID1均表现无互作或极弱的互作，而GA存在时，仅在DELLA域发生提前终止突变的RHT-B1b和RHT-B1e、在GRAS域发生移码突变的RHT-B1k和RHT-D1g与TaGID1不能产生相互作用，说明小麦Rht-1s基因所编码的DELLA蛋白与GA受体TaGID1蛋白在N端DELLA域存在着依赖于GA的相互作用。酵母双杂交检测发现，无论GA存在与否，在DELLA域发生提前终止突变的RHT-B1b和RHT-B1e、在VHIID域发生移码突变的RHT-B1k、以及在LHRII域发生错义突变的RHT-D1h与TaGID2不能产生相互作用，其余RHT-1s均能与TaGID2互作，说明小麦Rht-1s基因所编码的DELLA蛋白与SCF复合体F-box亚基TaGID2蛋白在C端LHRII域存在着不依赖于GA的相互作用。酵母三杂交结果表明，大部分RHT-1s与TaGID1A-TaGID2A的互作依赖于GA，即使GA存在，RHT-B1b、RHT-B1e、RHT-B1k、RHT-D1g、RHT-D1h也不与TaGID1A-TaGID2A产生相互作用，说明小麦GA信号传导途径基于GA-TaGID1-DELLA-TaGID2模式。 3.小麦Rht-1新等位基因启动子的克隆及功能分析 基因型和株高性状之间的关联分析发现，在Rht-D1a和Rht-D1b背景下，Rht-B1f等位基因都可以显著地增加株高。从含有不同Rht-1新等位变异的材料中分离到4种有一定活性的启动子序列，与Rht-B1a基因的启动子序列相比，分别为与之完全一致、有197bp片段插入、有160bp片段插入以及有20 bp片段缺失，并发现160bp片段插入特异存在于Rht-B1i等位基因材料中。通过分子标记和直接测序的方法，将Rht-B1f等位基因分为启动子有160bp片段插入的Rht-B1i-1和启动子无160bp片段插入的Rht-B1i-2。生物信息学分析发现，160bp片段插入使Rht-B1 i-1基因启动子比Rht-B1a基因启动子多出32个可能存在的元件，Rht-B1i基因启动子独有的生长素反应元件AUXREPSIAA4可能与Rht-B1i-1基因促进株高的效应有关。胚芽鞘长度和转基因拟南芥组织化学染色的分析结果表明，Rht-B1i-1基因促进株高的效应可能与GA和生长素之间的协同作用有关。