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研究背景:
全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者已超过3.5亿人，并呈上升趋势，主要分布在亚洲和非洲，每年大约有一百万人死于HBV相关的肝脏肿瘤。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，占癌症死亡率第二位，严重威胁着人们的健康。HBV感染是引起肝癌的主要原因之一，流行病学调查表明，HBV感染者发生HCC的几率较正常人高100倍，但HBV致癌的具体机制尚不明确。
乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质相互作用，从而调节基因表达与细胞蛋白质功能，进而影响病毒自身的复制、宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡等重要过程，HBx的这些功能可能在HBV相关性HCC的发生发展中起着重要作用，但其发挥作用的确切机制目前尚不清楚，有待于进一步研究阐明。
细胞凋亡(apoptosis)是由特定基因调控的程序性死亡，对维持机体的自身稳定性和防止恶性肿瘤的发生是十分重要的。细胞凋亡的紊乱与多种疾病与肿瘤包括HCC的发生密切相关。阿霉素(adriamycin，Adr)是一种临床上常用的抗肿瘤药物，它的主要作用机制是诱导肿瘤细胞DNA损伤和干扰DNA代谢，从而促进肿瘤细胞凋亡。阿霉素诱导肿瘤细胞凋亡的过程可能是通过p53-PTEN通路发挥作用的。
研究目的:
以阿霉素诱导HepG<,2>细胞凋亡作为模型，研究HBx对肝癌细胞凋亡的调控作用及其可能机制，进而为阐明HBx在HCC发生发展中的作用提供理论依据。
实验方法:
以adr亚型HBV质粒pHBV DNA为模板，采用PCR法扩增HBV X基因片段，并定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP．C1的HindIII和Kpn I酶切位点，并用HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切及测序鉴定以构建重组体pGFP/HBx。采用脂质体转染法将GFP真核表达载体pEGFP-C1、重组体pGFP-HBx转染HepG<,2>细胞，转染后36小时传细胞，用G418筛选出抗性细胞克隆，逐级扩大培养，在荧光显微镜下观察GFP-HBx融合蛋白表达，采用RT-PCR检测HBV X基因转录、表达，以建立稳定表达细胞系HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-HBx细胞。采用阿霉素(2.0ug/ml)分别处理HepG<,2>、HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-HBx细胞，阿霉素处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化、台盼兰染色计数死亡细胞。阿霉素处理后36小时，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，并采用RT-PCR检测p53、PTEN的转录表达，采用western blot检测p53、PTEN蛋白的表达。
实验结果:
经双酶切及测序鉴定成功构建了GFP与HBV X重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组体转染HepG<,2>，经G418筛选获得抗性细胞克隆；在荧光显微镜下见部分抗性克隆细胞表达较强的GFP荧光蛋白。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传70代，细胞仍表达强的荧光蛋白，RT-PCR检测表明转染重组体GFP-HBx的HepG<,2>/GFP-HBx细胞有HBV X基因转录、表达。在HepG<,2>、HepG<,2>/GFP细胞，阿霉素诱导了明显的凋亡性细胞死亡，表现为细胞变圆、脱落，而在HepG<,2>/GFP-HBx细胞，未见明显细胞死亡;流式细胞仪分析阿霉素处理后36小时HepG<,2>、HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-HBx细胞的凋亡率分别为59.03﹪，61.38﹪，4.21﹪。阿霉素处理后36小时，RT-PCR和western blot分析发现，与HepG<,2>、HepG<,2>/GFP细胞相比，HepG<,2>/GFP-HBx细胞的PTEN的转录和蛋白表达降低，而p53的转录和蛋白表达水平无明显变化。
结论:
1、成功构建了GFP-HBV X基因的真核重组表达载体pGFP-HBx，建立了稳定表达GFP、GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，为进一步研究：HBx的生物学功能及其在HBV感染致癌中的作用与机制提供了基础。
2、HBx能够抑制阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡。
3、 HBx抑制阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的机制可能是HBx下调PTEN的表达而抑制其功能；而HBx对阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的抑制可能并不通过影响p53的转录、表达而发挥作用。